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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 扩增测序正确，但是却双酶切不了，急！TT
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gstracy

新虫 (初入文坛)

[求助] 扩增测序正确，但是却双酶切不了，急！TT 已有1人参与

在上下游引物上分别加了 HindIII 和  NcoI 酶切位点，PCR后连到T载体上，测序显示扩增成功。
但是用这个两个酶却切不动，分开单酶切也不行，不知道问题出在哪了
图为设计的酶切位点

扩增测序正确，但是却双酶切不了，急！TT
1.png
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1楼 2015-06-29 20:08:22
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hutil1543

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
优化提质粒的方法，去乙醇彻底点。
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2楼2015-06-30 08:50:35
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gstracy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hutil1543 at 2015-06-30 08:50:35
优化提质粒的方法，去乙醇彻底点。

用的生工小提质粒试剂盒，重提质粒也双酶切不开，用NcoI 单酶切就可以切成线性的，HindIII还是切不了。
我现在考虑三个方面：
1.HindIII 酶切位点受甲基化影响
2.菌液转接的时候被污染或者突变
3.保护碱基的问题
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3楼2015-06-30 12:45:50
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baishujun

新虫 (初入文坛)
能说一下你的用量还有酶切的时间嘛？我是37摄氏度 30分钟 up to

发自小木虫IOS客户端
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4楼2016-03-28 11:08:43
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by baishujun at 2016-03-28 11:08:43
能说一下你的用量还有酶切的时间嘛？我是37摄氏度 30分钟 up to

我用公司返还的质粒，BamH1和EcoR1酶切4个小时，感觉还没有切开。。。
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5楼2016-03-28 17:36:30
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