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gstracy

新虫 (初入文坛)

[求助] 扩增测序正确,但是却双酶切不了,急!TT 已有1人参与

在上下游引物上分别加了 HindIII 和  NcoI 酶切位点,PCR后连到T载体上,测序显示扩增成功。
但是用这个两个酶却切不动,分开单酶切也不行,不知道问题出在哪了
图为设计的酶切位点

扩增测序正确,但是却双酶切不了,急!TT
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hutil1543

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
优化提质粒的方法,去乙醇彻底点。
2楼2015-06-30 08:50:35
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gstracy

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by hutil1543 at 2015-06-30 08:50:35
优化提质粒的方法,去乙醇彻底点。

用的生工小提质粒试剂盒,重提质粒也双酶切不开,用NcoI 单酶切就可以切成线性的,HindIII还是切不了。
我现在考虑三个方面:
1.HindIII 酶切位点受甲基化影响
2.菌液转接的时候被污染或者突变
3.保护碱基的问题
3楼2015-06-30 12:45:50
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baishujun

新虫 (初入文坛)

能说一下你的用量还有酶切的时间嘛?我是37摄氏度 30分钟 up to

发自小木虫IOS客户端
4楼2016-03-28 11:08:43
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by baishujun at 2016-03-28 11:08:43
能说一下你的用量还有酶切的时间嘛?我是37摄氏度 30分钟 up to

我用公司返还的质粒,BamH1和EcoR1酶切4个小时,感觉还没有切开。。。
5楼2016-03-28 17:36:30
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