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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 目的基因与载体双酶切后过夜连接，转化子在试管培养基中却长不出来？
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ivor0123

金虫 (初入文坛)

[求助] 目的基因与载体双酶切后过夜连接，转化子在试管培养基中却长不出来？ 已有4人参与

哪位大神可以指导我一下，目的基因与载体双酶切后，16℃过夜连接，转化感受态大肠杆菌BL21后，平皿上长出两三个转化子，还有许多小菌落，挑转化子到5ml试管培养基中培养了6个小时，菌却长不出来是怎么回事？载体是SM抗性的，应该没有加错抗性的。没有用菌落PCR验证，因为做酶反应也是可以验证的。谢谢啊！
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人生究竟是喜剧还是悲剧，并不取决于你生活的状态，而是取决于你看待自己人生的态度。
1楼 2015-03-07 23:07:33
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

随风飘摇11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
ivor0123: 金币+2, ★★★很有帮助 2015-03-11 12:49:21
没摇起来那假阳性的多，最好还是菌落pcr先初步鉴定一下

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天道酬勤
3楼2015-03-07 23:52:01
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ivor0123

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 随风飘摇11 at 2015-03-07 23:52:01
没摇起来那假阳性的多，最好还是菌落pcr先初步鉴定一下

不知道这个假阳性的菌落出现是什么情况，一般抗性平皿上能长出来的菌，挑到液体培养基中应该也能长的啊！求赐教啊！
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人生究竟是喜剧还是悲剧，并不取决于你生活的状态，而是取决于你看待自己人生的态度。
6楼2015-03-08 16:34:21
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普通回帖

随风飘摇11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
ivor0123: 金币+1, ★★★很有帮助 2015-03-11 12:49:38
为什么要转化BL21菌株？

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天道酬勤
2楼2015-03-07 23:51:01
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qaz139687

新虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 应助指数-1, 无应助 2015-03-08 19:36:00
请问你的酶切是着么做得呢
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4楼2015-03-08 12:27:38
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ivor0123

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 随风飘摇11 at 2015-03-07 23:51:01
为什么要转化BL21菌株？

我们实验室常用的表达载体就是BL21。
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人生究竟是喜剧还是悲剧，并不取决于你生活的状态，而是取决于你看待自己人生的态度。
5楼2015-03-08 16:31:49
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力攻

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ivor0123: 金币+2, ★★★很有帮助 2015-03-11 12:49:51
确定从开始的酶切到后面连接浓度都够吗？整套流程下来计算浓度是否按照摩尔浓度？
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7楼2015-03-08 18:34:22
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by ivor0123 at 2015-03-08 16:31:49
我们实验室常用的表达载体就是BL21。...

先转克隆菌株啊，BL21提质粒效果好吗？

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天道酬勤
8楼2015-03-08 20:08:05
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by ivor0123 at 2015-03-08 16:34:21
不知道这个假阳性的菌落出现是什么情况，一般抗性平皿上能长出来的菌，挑到液体培养基中应该也能长的啊！求赐教啊！...

长得时间太长了，或者抗性失效了，反正我之前也会出现这样的情况，后来果断就放弃了，重新酶连转化

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天道酬勤
9楼2015-03-08 20:09:53
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ivor0123

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by qaz139687 at 2015-03-08 12:27:38
请问你的酶切是着么做得呢

连接有目的基因的质粒与目的载体质粒分别双酶切过夜。目的基因是连载T载上的，现在的目的是将T载上的目的基因连接到另一个共表达质粒上，将原来共表达的质粒上的其中一个基因用目的基因替换掉。分别胶回收后，16摄氏度连接过夜。
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人生究竟是喜剧还是悲剧，并不取决于你生活的状态，而是取决于你看待自己人生的态度。
10楼2015-03-08 21:22:14
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