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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 目的基因与载体双酶切后过夜连接，转化子在试管培养基中却长不出来？
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ivor0123

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 随风飘摇11 at 2015-03-08 20:08:05
先转克隆菌株啊，BL21提质粒效果好吗？
...

目的基因是连在克隆载体上的，但是现在的目的是将克隆载体上的目的基因替换掉表达载体上的同源基因。这个应该跟BL21没有太大关系吧？
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人生究竟是喜剧还是悲剧，并不取决于你生活的状态，而是取决于你看待自己人生的态度。
11楼2015-03-08 21:24:52
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ivor0123

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 随风飘摇11 at 2015-03-08 20:09:53
长得时间太长了，或者抗性失效了，反正我之前也会出现这样的情况，后来果断就放弃了，重新酶连转化
...

如果抗性失效的话，平皿上应该能长很多菌啊。现在的情况是一块平皿上长了五个大菌落，周围长了很多小菌落。照理来说，长卫星菌落应该不影响中间的大菌落的吧？
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12楼2015-03-08 21:27:45
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ivor0123

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 力攻 at 2015-03-08 18:34:22
确定从开始的酶切到后面连接浓度都够吗？整套流程下来计算浓度是否按照摩尔浓度？

请问下，这个摩尔浓度要怎么计算啊？我们已经做连接做了好多次了，一直不成功，增加质粒浓度跟延长酶切时间都试过了，就是不长，难得长了，还没法用液体培养基培养出来，求赐教啊
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13楼2015-03-08 21:30:01
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by ivor0123 at 2015-03-08 21:27:45
如果抗性失效的话，平皿上应该能长很多菌啊。现在的情况是一块平皿上长了五个大菌落，周围长了很多小菌落。照理来说，长卫星菌落应该不影响中间的大菌落的吧？...

长了多长时间？

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天道酬勤
14楼2015-03-08 21:40:43
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力攻

木虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by ivor0123 at 2015-03-08 21:30:01
请问下，这个摩尔浓度要怎么计算啊？我们已经做连接做了好多次了，一直不成功，增加质粒浓度跟延长酶切时间都试过了，就是不长，难得长了，还没法用液体培养基培养出来，求赐教啊...

你可以找度娘，很容易找的。
整个流程再看看，从PCR开始，总之浓度都要高
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15楼2015-03-09 20:54:48
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力攻

木虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by ivor0123 at 2015-03-08 21:30:01
请问下，这个摩尔浓度要怎么计算啊？我们已经做连接做了好多次了，一直不成功，增加质粒浓度跟延长酶切时间都试过了，就是不长，难得长了，还没法用液体培养基培养出来，求赐教啊...

你可以找度娘，很容易找的。
整个流程再看看，从PCR开始，总之浓度都要高
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16楼2015-03-09 23:20:59
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五维度的爱

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ivor0123 at 2015-03-08 16:31:49
我们实验室常用的表达载体就是BL21。...

把连接产物先转化至克隆载体内，将得到的阳性克隆扩大培养后抽提质粒，之后转化至BL21感受态内
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17楼2015-03-10 10:15:58
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
最好先转化DH5a或者XL1-Blue,得到正确的克隆后，再将质粒直接转入BL21。
因为BL21摇菌的话，质粒也是很少的，不适合做克隆，适合表达。
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18楼2015-03-10 10:41:57
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