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潇潇溪

新虫 (初入文坛)

[求助] 中高拷贝重组载体酶切验证正确,但是提出的质粒浓度一直很低 已有4人参与

一个1000bp左右的条带连接到pQE30 载体上,菌落PCR验证正确,摇菌后提取质粒浓度很淡,但是酶切验证都正确。质粒浓度一直很淡,菌划线后重新挑取单菌落再提质粒还是很淡。且此片段连接过T载体,也是一样的情况。真是从来没有见过这种情况。请各位大侠帮帮找找问题。

中高拷贝重组载体酶切验证正确,但是提出的质粒浓度一直很低
20150430 pQE30-HA1 酶切验证.jpg
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潇潇溪

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by nemo88 at 2015-05-05 14:20:25
操作手段上,多摇点菌,裂解,离心去沉淀后,然后整个一个管子里提取

不知道PQE载体哪个系列,记得好像PBR系列复制子的质粒可以加氯霉素刺激质粒复制。。。

有考虑过这样来扩大培养,但是pQE30属于中高拷贝质粒,理论上5ml菌液提出的质粒也该有T载体亮度的80%。氯霉素刺激质粒复制这一说法我有听说过,目前没有试过,如果我新的办法还不行,会考虑这样做。
6楼2015-05-05 16:47:57
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nemo88

禁虫 (小有名气)

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-05-05 22:36:51
潇潇溪: 金币+1, 有帮助 2015-05-06 11:16:13
本帖内容被屏蔽

2楼2015-05-05 14:20:25
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sh_9153

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-05-05 22:37:10
质粒过大影响拷贝数吧,加大一下摇菌体系,多收集几管然后合起来,浓度过低加一步沉淀
3楼2015-05-05 15:07:31
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yzheng29

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你的DNA插入片段对宿主细胞的生长有没有妨碍?
4楼2015-05-05 15:17:03
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