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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 中高拷贝重组载体酶切验证正确，但是提出的质粒浓度一直很低
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潇潇溪

新虫 (初入文坛)

[求助] 中高拷贝重组载体酶切验证正确，但是提出的质粒浓度一直很低已有4人参与

一个1000bp左右的条带连接到pQE30 载体上，菌落PCR验证正确，摇菌后提取质粒浓度很淡，但是酶切验证都正确。质粒浓度一直很淡，菌划线后重新挑取单菌落再提质粒还是很淡。且此片段连接过T载体，也是一样的情况。真是从来没有见过这种情况。请各位大侠帮帮找找问题。

中高拷贝重组载体酶切验证正确，但是提出的质粒浓度一直很低
20150430 pQE30-HA1 酶切验证.jpg
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1楼2015-05-05 13:40:42
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潇潇溪

新虫 (初入文坛)
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4楼: Originally posted by yzheng29 at 2015-05-05 15:17:03
你的DNA插入片段对宿主细胞的生长有没有妨碍？

没有影响，过夜摇菌第二天看菌的浓度都OK，平板上看也没有问题，很正常。
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5楼2015-05-05 16:40:13
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潇潇溪

新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by nemo88 at 2015-05-05 14:20:25
操作手段上，多摇点菌，裂解，离心去沉淀后，然后整个一个管子里提取

不知道PQE载体哪个系列，记得好像PBR系列复制子的质粒可以加氯霉素刺激质粒复制。。。

有考虑过这样来扩大培养，但是pQE30属于中高拷贝质粒，理论上5ml菌液提出的质粒也该有T载体亮度的80%。氯霉素刺激质粒复制这一说法我有听说过，目前没有试过，如果我新的办法还不行，会考虑这样做。
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6楼2015-05-05 16:47:57
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潇潇溪

新虫 (初入文坛)
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3楼: Originally posted by sh_9153 at 2015-05-05 15:07:31
质粒过大影响拷贝数吧，加大一下摇菌体系，多收集几管然后合起来，浓度过低加一步沉淀

插入1000片段应该不会造成太大的负担，以前也做过更大的，都没有问题。如果实在不行，只能加大摇菌了。谢谢哈。
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7楼2015-05-05 16:52:35
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潇潇溪

新虫 (初入文坛)
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8楼: Originally posted by sh_9153 at 2015-05-06 09:13:07
我看成10000bp了~不好意思，1000bp没有问题的，你再试一下吧...

我把提出来的质粒再转化一下，今天就能提出很浓了，难道是之前的菌里面有很多不存在质粒？
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9楼2015-05-06 10:59:12
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