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小豆芽_won

银虫 (小有名气)

[求助] 求助为什么PCR条带比目的条带大很多 已有3人参与

在提取基因组后用设计的引物进行PCR,用的ExTaq酶,延伸时间是1分钟。我的目的基因为1080bp而跑出的条带比2000的MAKER也要大很多,但条带不是很亮。想知道有哪些可能得原因。
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小豆芽_won

银虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 王平阳 at 2015-03-26 13:23:54
你这个问题先要搞清楚几个前提:
第一,你所设计的引物是在基因组上还是cDNA上,如果在cDNA上,用基因组为模板PCR,中间如果有个内含子,扩增的片段就会比预期的要大;
第二,你扩增出的这个片段是否测序,有可能 ...

引物应该是在cdna上设计的,模板是基因组,但是PCR的延伸时间是1min ,应该不会扩增出很大的片段啊?
6楼2015-03-27 15:41:10
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小豆芽_won: 金币+5, 有帮助 2015-03-27 15:30:31
你没有说你的1080bp的目的条带是否也跑出来了?这很重要啊
todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
2楼2015-03-26 13:09:13
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王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小豆芽_won: 金币+10, ★★★很有帮助 2015-03-27 15:41:23
你这个问题先要搞清楚几个前提:
第一,你所设计的引物是在基因组上还是cDNA上,如果在cDNA上,用基因组为模板PCR,中间如果有个内含子,扩增的片段就会比预期的要大;
第二,你扩增出的这个片段是否测序,有可能是非特异性片段,建议引物在基因组数据库做个BLAST比对,排除非特异性扩增可能;
第三,可能是存在序列多态性,有些片段是可以移动的,比如转座子,我碰到过,中间插入一段或者缺失一段也可能导致这个现象,建议排查。
祝你好运
没有做不到,只有想不到!
3楼2015-03-26 13:23:54
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韩颖715

铁虫 (小有名气)

我觉得你的引物特异性不好,2000的条带应该不是目的条带
4楼2015-03-26 14:33:04
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