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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助为什么PCR条带比目的条带大很多
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小豆芽_won

银虫 (小有名气)

[求助] 求助为什么PCR条带比目的条带大很多 已有3人参与

在提取基因组后用设计的引物进行PCR，用的ExTaq酶，延伸时间是1分钟。我的目的基因为1080bp而跑出的条带比2000的MAKER也要大很多，但条带不是很亮。想知道有哪些可能得原因。
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1楼 2015-03-26 11:00:35
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小豆芽_won: 金币+5, ★有帮助 2015-03-27 15:30:31
你没有说你的1080bp的目的条带是否也跑出来了？这很重要啊
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
2楼2015-03-26 13:09:13
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王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小豆芽_won: 金币+10, ★★★很有帮助 2015-03-27 15:41:23
你这个问题先要搞清楚几个前提：
第一，你所设计的引物是在基因组上还是cDNA上，如果在cDNA上，用基因组为模板PCR，中间如果有个内含子，扩增的片段就会比预期的要大；
第二，你扩增出的这个片段是否测序，有可能是非特异性片段，建议引物在基因组数据库做个BLAST比对，排除非特异性扩增可能；
第三，可能是存在序列多态性，有些片段是可以移动的，比如转座子，我碰到过，中间插入一段或者缺失一段也可能导致这个现象，建议排查。
祝你好运
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没有做不到，只有想不到！
3楼2015-03-26 13:23:54
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韩颖715

铁虫 (小有名气)
我觉得你的引物特异性不好，2000的条带应该不是目的条带
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4楼2015-03-26 14:33:04
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小豆芽_won

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-03-26 13:09:13
你没有说你的1080bp的目的条带是否也跑出来了？这很重要啊

没有目的条带跑出来
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5楼2015-03-27 15:24:29
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小豆芽_won

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 王平阳 at 2015-03-26 13:23:54
你这个问题先要搞清楚几个前提：
第一，你所设计的引物是在基因组上还是cDNA上，如果在cDNA上，用基因组为模板PCR，中间如果有个内含子，扩增的片段就会比预期的要大；
第二，你扩增出的这个片段是否测序，有可能 ...

引物应该是在cdna上设计的，模板是基因组，但是PCR的延伸时间是1min ,应该不会扩增出很大的片段啊？
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6楼2015-03-27 15:41:10
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小豆芽_won

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 韩颖715 at 2015-03-26 14:33:04
我觉得你的引物特异性不好，2000的条带应该不是目的条带

有可能吧
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7楼2015-03-27 15:41:46
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王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 小豆芽_won at 2015-03-27 15:41:10
引物应该是在cdna上设计的，模板是基因组，但是PCR的延伸时间是1min ,应该不会扩增出很大的片段啊？...

以基因组为模板，为什么以cDNA为参考设计引物呢，会不会有内含子？如果引物是跨内含子的就可能扩增不出产物的哦
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没有做不到，只有想不到！
8楼2015-03-27 17:36:16
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小豆芽_won

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 王平阳 at 2015-03-27 17:36:16
以基因组为模板，为什么以cDNA为参考设计引物呢，会不会有内含子？如果引物是跨内含子的就可能扩增不出产物的哦...

忘了，我的目的基因是在细菌中的，不会有内含子存在的
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9楼2015-03-27 21:32:45
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baiying77

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
条带单一吗？如果不是单一的，那么在1000bp左右有没有条带？也可能是你引物设计的问题，特异性不是很好，引物设计好后，用Primer blast 检测一下
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10楼2015-03-28 21:51:26
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