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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 构建重组质粒后，利用酶切和PCR检测构建的重组质粒是否正确，但是
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monkey_pxs

金虫 (小有名气)

[求助] 构建重组质粒后，利用酶切和PCR检测构建的重组质粒是否正确，但是 已有1人参与

构建重组质粒后，利用酶切和PCR检测构建的重组质粒是否正确，先利用引物以重组质粒为模板通过PCR扩增却只得到小于100bp的条带；
利用酶切检测，单酶切双酶切都没有任何条带在泳道上出现。
另构建的重组质粒大小貌似大于空载体6.5kb+1.4kb目的产物，这是否也是检测失败的原因？
另构建重组质粒时，我是先酶切空载体去磷酸化再与同样去磷酸化的目的片段通过连接酶连接的，这样是否也是影响因素？

构建重组质粒后，利用酶切和PCR检测构建的重组质粒是否正确，但是
重组质粒酶切.png


构建重组质粒后，利用酶切和PCR检测构建的重组质粒是否正确，但是-1
重组质粒PCR.png
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人只有在真正做事过程中才会明白以前想的那些压抑难受什么的都是太闲了想多了的结果。
1楼 2015-03-06 16:36:59
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yesucao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你是单酶切插入目的片段的，载体经去磷酸化处理，目的片段是不用进行去磷酸化处理的。修改一下方法再做实验吧。
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2楼2015-03-09 11:34:54
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monkey_pxs

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yesucao at 2015-03-09 11:34:54
你是单酶切插入目的片段的，载体经去磷酸化处理，目的片段是不用进行去磷酸化处理的。修改一下方法再做实验吧。

今天已经意识到这个问题了，另外由于载体上的酶切位点和目的片段上的酶切位点不同，是否需要各自都补平末端，然后载体去磷酸化处理，目的片段只补平末端不磷酸化处理再连接就可以了？
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人只有在真正做事过程中才会明白以前想的那些压抑难受什么的都是太闲了想多了的结果。
3楼2015-03-09 20:55:45
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