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necrosis

新虫 (小有名气)

[求助] 请问qPCR时，目的基因与内参的CT值之差大于10，是不是说明表达非常低？？ 已有3人参与

我是qPCR新手，想请教大家两个问题，大家互相探讨。
1、我之前做过一个基因的普通PCR，跑胶结果显示样本A没有条带，B有明显的带，内参18S是齐的。然后同样的样本做了qPCR，发现样本A与18s的CT值之差为10左右，而样本B为2。我的问题是，目的基因与内参的CT 值之差大于10，是否说明目的基因表达量很低甚至不表达？这可以作为一个标准吗？如果不是这样，是否就只能与阴性对照（即不加cDNA模板）进行对比来判断基因是否不表达？
2、如果要用qPCR检测某个基因是否被敲除掉，可以用上面提到的方法吗？（与内参的CT值比较，或者与阴性对照CT值比较）
谢谢大家了！！！
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1楼 2015-02-13 13:21:53
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necrosis

新虫 (小有名气)
谢谢你，不知道还有没有人关注过△CT值与表达的关系
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2楼2015-02-13 13:45:28
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bbqlhb

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
necrosis(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-02-13 20:56:48
引用回帖:
2楼: Originally posted by necrosis at 2015-02-13 13:45:28
谢谢你，不知道还有没有人关注过△CT值与表达的关系

你别吓我。。。你在谢谁呢。。
1、可以作为一个标准。阴性对照是用来检测你本次试验有没污染。
2、看基因有没被敲除，你直接用这个基因的探针来钓。P不出来就是没啊。。
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3楼2015-02-13 15:21:00
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necrosis

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by bbqlhb at 2015-02-13 15:21:00
你别吓我。。。你在谢谁呢。。
1、可以作为一个标准。阴性对照是用来检测你本次试验有没污染。
2、看基因有没被敲除，你直接用这个基因的探针来钓。P不出来就是没啊。。...

追问一下：你说的“P不出来”有没有判断标准呢？如果是半定量应该就是没有条带，那如果用qPCR怎么判断呢？
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4楼2015-02-13 22:23:41
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
内参都是浓度相对很高的RNA，差10个Ct还可以接受
Ct在30以下一般都没问题，如果含量太低可以适当提高模板浓度弥补下
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
5楼2015-02-14 06:42:50
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夜舞龙

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
只能说明表达量比内参低,只要在规定范围内有值就应该有表达,具体多低要看内参本身情况,非要精确可进行绝对定量

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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6楼2015-02-15 12:22:40
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夜舞龙

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

看基因是否敲除得看具体情况,什么技术敲除的,引物设计在哪,最好设计时就弄成如果敲除就彻底P不出

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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7楼2015-02-15 12:27:51
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