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laoyisng1122

铁虫 (正式写手)

[交流] 做了几次PCR CT值都有变化怎么办？谢谢大家！！

荧光定量PCR标准品的问题
我自己用质粒做的标准品，可是做了几次PCR CT值都有变化怎么办，还有标准品在4度好，还是-20好，如果4度能保存多长时间
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1楼 2011-12-14 12:11:15
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fajiaoren

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★
laoyisng1122(金币+1):谢谢参与
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-12-14 16:02:07
-20度好，检查你的试剂，哪个公司的，质量如果。4度要尽快用，几天应该是可以的。
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2楼2011-12-14 15:33:23
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ccharlien

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+1): Ct值每次PCR都会有差别的，而且跟阈值设置也有关。不知道楼主说的差别有多大…… 2011-12-15 23:34:52
有变化能变多少呀？阈值设定一致的么？
CT值有变化问题不大 关键是标准曲线质量如何 效率 相关系数
标准品还是分装了放-20吧
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3楼2011-12-14 19:09:25
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cloverplm

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+2): 鼓励应助 2011-12-15 23:35:07

你的标准品稀释得准确么？
要不测一下质粒的浓度吧，如果稀释得不准确标准曲线不可能做得好的。
另外样品还是分装了放-20℃吧，做荧光定量加样要特别注意的，因为一般质粒浓度都很大，加样稍有偏差对结果都有很大影响。
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4楼2011-12-14 22:48:04
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yambog

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
加油啊，好好找找原因....
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5楼2011-12-15 03:49:28
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xiuwei001

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
用什么稀释的标准品，好像有专门稀释标准品的solution
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6楼2011-12-15 08:12:39
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beautybanana

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
你所说的CT值变化是指标准品的标准曲线的CT值变化吗？
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7楼2011-12-15 08:51:02
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laoyisng1122

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by fajiaoren at 2011-12-14 15:33:23:
-20度好，检查你的试剂，哪个公司的，质量如果。4度要尽快用，几天应该是可以的。

还有我要同时测两个基因，怎样能保证两个基因的检测效率是相同的
我是做了两个标准品，可是斜率相差多少以内才能算是扩增效率一致呢？以前的文献只写要保证两个基因的扩增效率一致
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8楼2011-12-15 10:34:34
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laoyisng1122

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ccharlien at 2011-12-14 19:09:25:
有变化能变多少呀？阈值设定一致的么？
CT值有变化问题不大 关键是标准曲线质量如何 效率 相关系数
标准品还是分装了放-20吧

还有我要同时测两个基因，怎样能保证两个基因的检测效率是相同的
我是做了两个标准品，可是斜率相差多少以内才能算是扩增效率一致呢？以前的文献只写要保证两个基因的扩增效率一致
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9楼2011-12-15 10:34:44
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laoyisng1122

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cloverplm at 2011-12-14 22:48:04:

你的标准品稀释得准确么？
要不测一下质粒的浓度吧，如果稀释得不准确标准曲线不可能做得好的。
另外样品还是分装了放-20℃吧，做荧光定量加样要特别注意的，因为一般质粒浓度都很大，加样稍有偏差对结 ...

还有我要同时测两个基因，怎样能保证两个基因的检测效率是相同的
我是做了两个标准品，可是斜率相差多少以内才能算是扩增效率一致呢？以前的文献只写要保证两个基因的扩增效率一致
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10楼2011-12-15 10:34:55
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laoyisng1122

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by beautybanana at 2011-12-15 08:51:02:
你所说的CT值变化是指标准品的标准曲线的CT值变化吗？

还有我要同时测两个基因，怎样能保证两个基因的检测效率是相同的
我是做了两个标准品，可是斜率相差多少以内才能算是扩增效率一致呢？以前的文献只写要保证两个基因的扩增效率一致
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11楼2011-12-15 10:35:12
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lycq

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
希望看到高人的解答，我也遇到了同样的问题
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12楼2011-12-15 10:47:42
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ccharlien

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+1): good 2011-12-15 23:43:51
引用回帖:
9楼: Originally posted by laoyisng1122 at 2011-12-15 10:34:44:
还有我要同时测两个基因，怎样能保证两个基因的检测效率是相同的
我是做了两个标准品，可是斜率相差多少以内才能算是扩增效率一致呢？以前的文献只写要保证两个基因的扩增效率一致

用斜率算一下扩增效率
既然你有两根标准曲线 就可以用标准曲线做相对定量 比delta delta Ct 的方法更符合实际 不用考虑效率不同的问题
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13楼2011-12-15 15:15:24
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wangleimin

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
学习中 希望楼主早日解决问题
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14楼2011-12-15 18:33:52
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cloverplm

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by laoyisng1122 at 2011-12-15 10:34:55:
还有我要同时测两个基因，怎样能保证两个基因的检测效率是相同的
我是做了两个标准品，可是斜率相差多少以内才能算是扩增效率一致呢？以前的文献只写要保证两个基因的扩增效率一致

要证明检测效率差不多，估计只能做多次重复试验了，然后你用统计学方法对结果进行分析，看看P值，判断差异是不是不显著。

统计学分析，偶当初论文的痛处，折腾死我了，祝你好运！
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15楼2011-12-15 20:48:56
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yzhlasiI

铁虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
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16楼2011-12-20 11:14:20
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laoyisng1122

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by ccharlien at 2011-12-15 15:15:24:
用斜率算一下扩增效率
既然你有两根标准曲线 就可以用标准曲线做相对定量 比delta delta Ct 的方法更符合实际 不用考虑效率不同的问题

首先谢谢诸位热心回答
做标准品的时候，两个质粒都测OD值了，因为我最后要计算同一样本两个基因的值的比，如果二者扩增效率不一致，怎么进行计算啊。我现在做的其中一个基因在10 8 copies/ul的时候CT值在8左右，斜率是2.9-3左右，而另一基因同等浓度的时候CT值在10左右，斜率是3.3-3.5，已经做过两次了，都是这样，这是什么原因呢？
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17楼2011-12-20 11:15:18
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laoyisng1122

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by cloverplm at 2011-12-15 20:48:56:
要证明检测效率差不多，估计只能做多次重复试验了，然后你用统计学方法对结果进行分析，看看P值，判断差异是不是不显著。

统计学分析，偶当初论文的痛处，折腾死我了，祝你好运！

首先谢谢诸位热心回答
做标准品的时候，两个质粒都测OD值了，因为我最后要计算同一样本两个基因的值的比，如果二者扩增效率不一致，怎么进行计算啊。我现在做的其中一个基因在10 8 copies/ul的时候CT值在8左右，斜率是2.9-3左右，而另一基因同等浓度的时候CT值在10左右，斜率是3.3-3.5，已经做过两次了，都是这样，这是什么原因呢？
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18楼2011-12-20 11:15:28
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ccharlien

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
17楼: Originally posted by laoyisng1122 at 2011-12-20 11:15:18:
首先谢谢诸位热心回答
做标准品的时候，两个质粒都测OD值了，因为我最后要计算同一样本两个基因的值的比，如果二者扩增效率不一致，怎么进行计算啊。我现在做的其中一个基因在10 8 copies/ul的时候CT值在8左右， ...

效率不一致是很正常的 一般来说你的引物和探针确定了之后 扩增效率就差不多定下来了 不同的反应体系会对其有一定程度的影响 你可以尝试一下
计算很容易啊 有标准曲线就不用CT值算了 用标准曲线的方法做相对定量
而且你用质粒做的标准品可以做绝对定量了 何必纠结CT值
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19楼2011-12-20 21:50:59
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yanjiwuluo

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
鎴戞兂闂竴涓嬶紝浣犵殑鏍囧噯鍝?鍘诲摢寮勫埌鐨勫憖
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20楼2012-12-25 14:00:52
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