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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 两次qPCR结果相差太大。。。。U6 Ct值应该是多少
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louisa俊

银虫 (小有名气)

[求助] 两次qPCR结果相差太大。。。。U6 Ct值应该是多少

最近做了2次qPCR,结果相差太大。。。用的内参是U6，发现U6的数值相差太大，想请教一下U6 的Ct值究竟是多少？为什么两次实验U6的Ct值会相差那么多？？还有就是引物能用DEPC水稀释吗？？对引物有没有影响？？谢谢
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1楼 2013-06-04 21:47:44
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
louisa俊(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-06-05 11:42:26
CT值依据加入模板量，如果相差太大应该是操作的问题，最大的可能是加入模板的量不太一致，即加模板时枪头里没打干净。引物可以用灭菌水直接稀释。
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2楼2013-06-05 07:56:58
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froess

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
louisa俊(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-06-05 11:42:34
首先你提出的问题有些不严谨，其实对于种属之间U6的表达量是有差异的。建议保证实验条件相同。如果你保证前后实验条件相同，那我觉得有个很严重的问题，U6在你做的实验中表达不稳定，所以导致相差太大。
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3楼2013-06-05 10:37:49
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+2, 鼓励 2013-06-09 14:12:06
可以用来做内参的基因很多，到底用哪个基因做内参需要看你的模板来源，有一个专门的内参选择软件，但可以用来做内参的一般是表达量高且表达水平比较恒定的基因，你这个U6不知道符不符合条件，另外引物直接用灭菌水稀释，一点影响都没有
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4楼2013-06-05 15:25:32
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louisa俊

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by chenguestc at 2013-06-05 07:56:58
CT值依据加入模板量，如果相差太大应该是操作的问题，最大的可能是加入模板的量不太一致，即加模板时枪头里没打干净。引物可以用灭菌水直接稀释。

恩。非常感谢。下次加样的时候，我会尽量保持一致，谢谢！！
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5楼2013-06-06 09:00:28
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louisa俊

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by songzuowei at 2013-06-05 15:25:32
可以用来做内参的基因很多，到底用哪个基因做内参需要看你的模板来源，有一个专门的内参选择软件，但可以用来做内参的一般是表达量高且表达水平比较恒定的基因，你这个U6不知道符不符合条件，另外引物直接用灭菌水稀 ...

我们做的基因一直是用U6做内参的，qPCR的结果，有两个U6值是17点几。还有一个突然变成20几了，我觉得这样的结果是不正常的
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6楼2013-06-06 09:02:02
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louisa俊

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by froess at 2013-06-05 10:37:49
首先你提出的问题有些不严谨，其实对于种属之间U6的表达量是有差异的。建议保证实验条件相同。如果你保证前后实验条件相同，那我觉得有个很严重的问题，U6在你做的实验中表达不稳定，所以导致相差太大。

U6表达不稳定？？？？？U6是内参，一般来说，都是稳定表达的啊
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7楼2013-06-06 09:02:52
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froess

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by louisa俊 at 2013-06-06 09:02:52
U6表达不稳定？？？？？U6是内参，一般来说，都是稳定表达的啊...

U6是内参没错，但在某些组织里，它也并非稳定表达。只是提出疑问，你可以再找找文献哈
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8楼2013-06-09 12:38:08
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louisa俊

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by froess at 2013-06-09 12:38:08
U6是内参没错，但在某些组织里，它也并非稳定表达。只是提出疑问，你可以再找找文献哈...

好的，谢谢哈
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9楼2013-06-09 15:27:44
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