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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 半定量RT-PCR中的引物二聚体
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lu12306

新虫 (初入文坛)

[求助] 半定量RT-PCR中的引物二聚体已有2人参与

最近在做半定量RT-PCR，从cDNA中能批出目的基因和内参基因，但胶的下面会有引物二聚体。我想问一下做半定量RT-PCR实验是不是得要求没有引物二聚体？引物二聚体会影响结果吗？如果有影响是不是只能重新设计引物？谢谢大家的解答啦！
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1楼2014-12-29 21:34:44
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董博士

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-01-07 16:43:31
有引物二聚体应该没什么关系，但还是应该尽量避免或者要很淡，建议PCR体系中引物可以减少试试
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医学&统计学
2楼2015-01-04 15:48:27
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甲方不怕乙方

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-01-07 16:43:34
我做的时候也是有大量的引物二聚体，比目的条带亮的多，但是应该不影响结果，所以没必要太担心，加油，祝好
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我要让你的生活因为有我而更精彩
3楼2015-01-04 16:31:15
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lu12306

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 董博士 at 2015-01-04 15:48:27
有引物二聚体应该没什么关系，但还是应该尽量避免或者要很淡，建议PCR体系中引物可以减少试试

谢谢你的答复。我发现如果我在PCR仪升到72度以上再放样进去，引物二聚体会少很多。很开心！
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4楼2015-01-05 10:55:11
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lu12306

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 甲方不怕乙方 at 2015-01-04 16:31:15
我做的时候也是有大量的引物二聚体，比目的条带亮的多，但是应该不影响结果，所以没必要太担心，加油，祝好

谢谢你的鼓励！我还想问一下：1.我做不同组织的半定量，还需要摸索不同组织的最佳循环数吗？ 2.同管扩增的话，是将PCR体系乘以2倍吗？3.我扩增的目的基因约1000bp，是不是太大？对结果有影响？有人建议做300-500bp的。这有硬性要求吗？4.你觉得我这个18SrRNA的最佳循环数应该是多少？怎么确定的？
半定量RT-PCR中的引物二聚体
18SRNA最佳循环数.PNG
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5楼2015-01-05 11:34:45
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lu12306

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lu12306 at 2015-01-05 10:55:11
谢谢你的答复。我发现如果我在PCR仪升到72度以上再放样进去，引物二聚体会少很多。很开心！...

你好！我还想问一下：1.我做不同组织的半定量，还需要摸索不同组织的最佳循环数吗？ 2.同管扩增的话，是将PCR体系乘以2倍吗？3.我扩增的目的基因约1000bp，是不是太大？对结果有影响？有人建议做300-500bp的。这有硬性要求吗？4.你觉得我这个18SrRNA的最佳循环数应该是多少？怎么确定的？
半定量RT-PCR中的引物二聚体-1
18SRNA最佳循环数.PNG
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6楼2015-01-05 11:36:08
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甲方不怕乙方

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-01-07 16:43:46
引用回帖:
4楼: Originally posted by lu12306 at 2015-01-05 10:55:11
谢谢你的答复。我发现如果我在PCR仪升到72度以上再放样进去，引物二聚体会少很多。很开心！...

同学，你能具体说说升到72度是个什么意思吗？只是简单的把pcr亿升到72度吗？需要把pcr体系在72度孵育一段时间吗？

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我要让你的生活因为有我而更精彩
7楼2015-01-07 11:29:16
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lu12306

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 甲方不怕乙方 at 2015-01-07 11:29:16
同学，你能具体说说升到72度是个什么意思吗？只是简单的把pcr亿升到72度吗？需要把pcr体系在72度孵育一段时间吗？
...

呵呵  我没说清楚   就是在开始94度预变性时升到的72度再放样
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8楼2015-01-22 15:21:00
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momo12345678

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 甲方不怕乙方 at 2015-01-07 11:29:16
同学，你能具体说说升到72度是个什么意思吗？只是简单的把pcr亿升到72度吗？需要把pcr体系在72度孵育一段时间吗？
...

楼主用的应该是热启动酶 我们也是需要将pcr仪预热升温到接近95℃按暂停 放样 开跑 如果不是热启动酶好像没有这个要求

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9楼2016-02-29 17:31:17
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