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pliu6682

木虫 (正式写手)

[求助] pcr 引物二聚体出现是不是在酶的作用下产生的

各位大侠，我想验证自己pcr酶的活性，但只出现了引物二聚体，做的对照是有目的条带p出来。我想问，引物二聚体是在Taq酶的作用下形成的，还是自身在温度变化时聚合形成的啊？出了引物二聚体是不是说明我的酶是没问题的哪？
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1楼 2012-12-31 09:09:28
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by pliu6682 at 2012-12-31 10:29:17
如果没有酶的话，引物二聚体是不会出现的，是吗？...

不是不会出现，是会形成，但量不足以观察到。
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4楼2012-12-31 13:12:01
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-31 09:30:49
引物二聚体自身是可以聚合，在酶的作用下，可以用dNTP为底物扩增。如果没有聚合酶，通常PCR反应中加入的引物量应该很难跑胶检测出来的。如果看到明显的引物二聚体，DNA聚合酶应该是起作用的。

用EB胶所能检测到核酸的最低量是ng级别的，何况是分子量如此小的引物二聚体呢，没有几十ng是看不见的。而普通PCR引物的用量是pg级别的，即使全上上去也看不见的。如果看见的话说明你把引物浓度用错了。
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5楼2012-12-31 13:15:13
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

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9楼: Originally posted by pliu6682 at 2012-12-31 13:40:00
我不是用的master mix，主要是实验酶的效果怎么样。一种是市面买的酶，一种是自己制备的。结果自己制备的酶只有二聚体。所以纠结要不要继续做下去。...

你是说用同样的体系，买的酶可以P出来，但自己做的酶只有引物二聚体吗？不同的酶对引物和模板浓度的要求不一样的，也许你没有找到最适合的条件吧。
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10楼2012-12-31 16:52:38
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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pliu6682: 金币+1, ★有帮助, 请问有没有理论依据，谢谢 2012-12-31 10:31:08
pliu6682: 金币+4, ★★★很有帮助, 还是谢谢了 2013-01-10 11:15:34
引物二聚体自身是可以聚合，在酶的作用下，可以用dNTP为底物扩增。如果没有聚合酶，通常PCR反应中加入的引物量应该很难跑胶检测出来的。如果看到明显的引物二聚体，DNA聚合酶应该是起作用的。
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2楼2012-12-31 09:30:49
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pliu6682

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-31 09:30:49
引物二聚体自身是可以聚合，在酶的作用下，可以用dNTP为底物扩增。如果没有聚合酶，通常PCR反应中加入的引物量应该很难跑胶检测出来的。如果看到明显的引物二聚体，DNA聚合酶应该是起作用的。

如果没有酶的话，引物二聚体是不会出现的，是吗？
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3楼2012-12-31 10:29:17
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pliu6682

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-31 13:12:01
不是不会出现，是会形成，但量不足以观察到。...

好，谢谢。就是说酶应该是有活力的，对吗？
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6楼2012-12-31 13:15:59
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by pliu6682 at 2012-12-31 13:15:59
好，谢谢。就是说酶应该是有活力的，对吗？...

不知道你在纠结什么。不是有阳性扩增吗？你做CR的时候是做master mix吧，说明酶没问题的吧。
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7楼2012-12-31 13:24:20
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pliu6682

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-31 13:24:20
不知道你在纠结什么。不是有阳性扩增吗？你做CR的时候是做master mix吧，说明酶没问题的吧。...

我用的酶不一样，主要想试试自己的酶效果怎么样。结果只有二聚体出现。
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8楼2012-12-31 13:33:46
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pliu6682

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-31 13:24:20
不知道你在纠结什么。不是有阳性扩增吗？你做CR的时候是做master mix吧，说明酶没问题的吧。...

我不是用的master mix，主要是实验酶的效果怎么样。一种是市面买的酶，一种是自己制备的。结果自己制备的酶只有二聚体。所以纠结要不要继续做下去。
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9楼2012-12-31 13:40:00
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