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韩元富豪

金虫 (小有名气)

[求助] PCR产物,只有引物二聚体,,怎么办 已有10人参与

小妹已经做了多次基因组DNAPCR,每次扩增出来的只有引物二聚体,连目标条带都没有,我设置的pcr参数是:
F1:2ul
F2:2ul
DNA模板:2ul
PCR Mix:25ul
ddH2O:19ul
两条引物的Tm分别是70.7、64.4,我设的PCR的Tm是60,扩增出来只有引物二聚体.又用60的退火温度做了一次,还是只有引物二聚体,怎么办
,
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userhung

禁虫 (文学泰斗)

木虫博士

帮顶,blessing, blessing, blessing ! ~~~
4楼2014-04-16 18:47:31
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yuren2009

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
韩元富豪: 金币+1 2014-04-17 21:38:41
我感觉你还是从引物特异性分析,其次再筛选退火温度。退火温度不一定非得低于TM值5度以下,为什么不从较低的那个TM值开始呢?
学习使你立于不败之地
5楼2014-04-16 20:15:54
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for5

木虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 韩元富豪 at 2014-04-16 20:57:59
买的PCR仪不能设置温度梯度,我用65,60 的退火温度,温度继续降,是为什么呢...

touchdown不涉及温度梯度,你去PCR仪上去找找。
温度越低特异性越差,看到底能不能P出你的基因,如果还是不行,那就换引物吧
操蛋的XX
8楼2014-04-16 21:26:36
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普通回帖

for5

木虫 (正式写手)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
韩元富豪(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-16 19:19:07
温度继续降,直到p出来为止。或者设一个touchdown的程序,设一个初始温度,一个降低温度以及一个终点温度

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
操蛋的XX
2楼2014-04-16 18:11:55
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04010126

铁杆木虫 (知名作家)

不以物喜,不以己悲!
3楼2014-04-16 18:38:46
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
韩元富豪: 金币+1 2014-04-17 21:38:54
引物特异性低些,做个梯度看看选择好的退火温度。
hehe
6楼2014-04-16 20:38:03
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韩元富豪

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by for5 at 2014-04-16 18:11:55
温度继续降,直到p出来为止。或者设一个touchdown的程序,设一个初始温度,一个降低温度以及一个终点温度

买的PCR仪不能设置温度梯度,我用65,60 的退火温度,温度继续降,是为什么呢
7楼2014-04-16 20:57:59
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永峰1230

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
韩元富豪: 金币+1 2014-04-17 21:39:05
引用回帖:
8楼: Originally posted by for5 at 2014-04-16 21:26:36
touchdown不涉及温度梯度,你去PCR仪上去找找。
温度越低特异性越差,看到底能不能P出你的基因,如果还是不行,那就换引物吧...

支持,,也可以先把引物的量加少些,1微升

[ 发自小木虫客户端 ]
12
9楼2014-04-17 08:14:51
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)

片段已知吗?如果已知做过梯度,总能P出来,如果未知就得考虑引物特异性了,P不出来可能是引物不特异
10楼2014-04-17 10:23:15
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