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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 各位学长、学姐帮帮忙，PCR只有引物二聚体
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韩元富豪

金虫 (小有名气)

[求助] 各位学长、学姐帮帮忙，PCR只有引物二聚体 已有11人参与

设计的一对引物，Tm值分别是72℃、67.2℃，尝试的温度有66℃、65℃、64℃、63℃、62℃，但都只有引物二聚体，怎么办，（先前提模板DNA时有条带，但PCR的时候就只有引物二聚体了），已经做了好长时间了，怎么办，求指点
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1楼 2014-05-05 11:02:08
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

fuchange918

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
韩元富豪(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-05-06 18:07:31
韩元富豪: 金币+3, ★有帮助, 谢谢啦，我再试试 2014-05-09 13:06:13
如果是引物合成单上的退火温度的话，根据它给的退火温度减5度左右是很难P出来的，我一般用英俊合成引物，合成单上有两个Tm值，一个大的一个小的，我的一般都是大的那个Tm值减去10度多才能跑出目的片段，不知道你的这个Tm值是怎么确定的，我估计是你P的那几个退火温度是太高了。建议以55度为中心，上下加减5度，共10个梯度，应该就能出来了
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10楼2014-05-06 15:58:56
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普通回帖

zep616745243

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-05 15:55:49
确保模板没有问题的前提下，可以试试降低退火温度吧，真不行就换引物吧
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只有不断地失败才会成功
2楼2014-05-05 12:26:24
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BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-05 15:55:56
你的模版是什么？基因组？
基因组DNA变性有点困难，可以考虑加DMSO。
把退火温度降到50度，看看有没有条带。如果没有条带果断换模版与引物。如果有带，继续优化PCR条件。
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3楼2014-05-05 12:34:25
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韩元富豪

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by BioChen at 2014-05-05 12:34:25
你的模版是什么？基因组？
基因组DNA变性有点困难，可以考虑加DMSO。
把退火温度降到50度，看看有没有条带。如果没有条带果断换模版与引物。如果有带，继续优化PCR条件。

模板是解淀粉芽孢杆菌中的pyrr基因，设计了两组引物：上游同源臂和下游同源臂，PCR的时候都只是引物二聚体，查看了这 个种的所有pyrr基因，在设计引物的那个片段，只有一个碱基不一样，其他都一样，下游同源臂引物未加被保护碱基和酶切位点的时候Tm是65.6和64.3，加了之后变成了72,67.2 。那Tm值多少合适呢
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4楼2014-05-05 14:28:12
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BioChen

银虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 韩元富豪 at 2014-05-05 14:28:12
模板是解淀粉芽孢杆菌中的pyrr基因，设计了两组引物：上游同源臂和下游同源臂，PCR的时候都只是引物二聚体，查看了这 个种的所有pyrr基因，在设计引物的那个片段，只有一个碱基不一样，其他都一样，下游同源臂引物 ...

Tm值只是一个参考，我设计引物的时候基本上不太关注Tm值。无论Tm值是多少，我拿到引物之后，都会做一个梯度PCR，确定最佳退火温度。
你现在的问题是PCR出不来，所以尽可能的降低退火温度，加DMSO是促进基因组DNA的变性。
我问的模版是什么不是问你克隆什么基因，问的是你的模版是基因组、cDNA还是质粒？
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5楼2014-05-06 10:35:25
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韩元富豪

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by BioChen at 2014-05-06 10:35:25
Tm值只是一个参考，我设计引物的时候基本上不太关注Tm值。无论Tm值是多少，我拿到引物之后，都会做一个梯度PCR，确定最佳退火温度。
你现在的问题是PCR出不来，所以尽可能的降低退火温度，加DMSO是促进基因组DNA的 ...

模板是基因组
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6楼2014-05-06 12:20:39
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sakor

铁虫 (初入文坛)
退火温度58至60差不多了
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7楼2014-05-06 12:36:39
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
韩元富豪: 金币+2, 谢谢啦，我再试试 2014-05-09 13:06:58
韩元富豪: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-05-10 13:12:04
不知道引物多长，但是我觉得退火温度太高了，我一般都用54-56度；60度以上就是很难扩增出来。
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8楼2014-05-06 15:13:36
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千年觉哲

金虫 (初入文坛)

金冲冲

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引物浓度  退火温度  模板浓度 都可调的
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顶顶顶
9楼2014-05-06 15:29:59
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