24小时热门版块排行榜    

查看: 2711  |  回复: 18

韩元富豪

金虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by fuchange918 at 2014-05-06 15:58:56
如果是引物合成单上的退火温度的话,根据它给的退火温度减5度左右是很难P出来的,我一般用英俊合成引物,合成单上有两个Tm值,一个大的一个小的,我的一般都是大的那个Tm值减去10度多才能跑出目的片段,不知道你的这 ...

用pp5得到的Tm是64.3和65.6,加上酶切位点和保护碱基后,即引物合成单上的是67.2和65.6,该怎么确定退货温度呢
11楼2014-05-06 18:02:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

PCR-CL

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
扩增目的基因问题:
1、引物与要扩增序列的同源性?要在保守区设计。引物3端序列一定要完全匹配!
2、退火温度55就行。
3、模板加量约100ng\50ul体系。
4、扩增的聚合酶质量和性能要好。LATaq系列就行。
12楼2014-05-06 21:37:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fuchange918

木虫 (正式写手)

引用回帖:
11楼: Originally posted by 韩元富豪 at 2014-05-06 18:02:02
用pp5得到的Tm是64.3和65.6,加上酶切位点和保护碱基后,即引物合成单上的是67.2和65.6,该怎么确定退货温度呢...

你最好是在55度左右做的梯度PCR ,现在的PCR仪都可以设置梯度吧
13楼2014-05-06 21:41:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

pc012351

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
酶切位点和保护碱基不计算退火温度的,你这个估计五十几度的退火温度差不多了
14楼2014-05-07 17:07:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ivyvampire

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

退火温度上下加减5度,跑个梯度PCR,模板引物量严格按照说明书(如果买的PCR mix)操作,如果还P不出来,应该是你那模板根本不对,或者你引物没设计好
好吧,我之前做实验,我导师给了我一个菌株,我一直P不出来,后来弄了一对引物,刚好扩出一点片段,但大小不对,我也拿去测序,结果发现他拿给我的菌株根本不是实验要用的菌株
15楼2014-05-09 09:27:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

快乐农夫

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

重新设计引物啊,你的引物的退火温度也太高了,延伸温度才72,你到底是退火呢还是延伸呢?引物能退火到模板上才怪呢,估计不是GC太多就是形成二级结构了,设计的时候保持在55度左右,而且两个引物之间的退火温度不要相差那么大,最多一两度,实在不行我给你设计个
16楼2014-05-09 12:01:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

曼舞流苏

新虫 (小有名气)

引用回帖:
16楼: Originally posted by 快乐农夫 at 2014-05-09 12:01:06
重新设计引物啊,你的引物的退火温度也太高了,延伸温度才72,你到底是退火呢还是延伸呢?引物能退火到模板上才怪呢,估计不是GC太多就是形成二级结构了,设计的时候保持在55度左右,而且两个引物之间的退火温度不要 ...

好人你帮我设计一个吧。。我做的是人晶状体上皮细胞,目的蛋白是E-Cadherin。好人你若是看到了,帮我设计一个撒,不胜感激!!!
17楼2015-03-09 16:30:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gnot_nail

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

内容已删除
18楼2015-03-09 17:24:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

第一点,设计的引物完全不合理,那无论怎么扩增都是失败。其次,引物如果你认为还是合理的,但是摸索了条件,比如尝试了很多不同的温度,或镁离子浓度,还是只有引物二聚体的话,这时候就不应该在考虑引物有问题了,因为你在怎么优化还是扩增不出来。这时候,想想你提的模板是否有降解,模板降解了扩增出来的是非特异性产物,还有就是扩增使用的试剂,比如说酶,是否是质量太差,特异性太差,一般小于10kb的模板建议使用热启动酶,大于15kb的模板建议使用长片段高保真酶,如果你是在进行突变检测等高要求的实验,建议使用高保真甚至超保真聚合酶
todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
19楼2015-03-10 10:57:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 韩元富豪 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 327求调剂 +6 拾光任染 2026-03-15 11/550 2026-03-15 22:47 by 拾光任染
[考研] 本人考085602 化学工程 专硕 +7 不知道叫什么! 2026-03-15 8/400 2026-03-15 20:11 by 棒棒球手
[考研] 070305求调剂 +3 mlpqaz03 2026-03-14 4/200 2026-03-15 11:04 by peike
[考研] 288求调剂 +4 奇点0314 2026-03-14 4/200 2026-03-14 23:04 by JourneyLucky
[考研] 268求调剂 +5 一定有学上- 2026-03-14 6/300 2026-03-14 22:20 by 运气yunqi
[考研] 297求调剂 +4 学海漂泊 2026-03-13 4/200 2026-03-14 11:51 by 热情沙漠
[考研] 0703化学求调剂 +5 很老实人 2026-03-09 5/250 2026-03-14 02:57 by JourneyLucky
[考研] 301求调剂 +3 归零lbm 2026-03-09 3/150 2026-03-14 02:20 by JourneyLucky
[考研] 环境调剂 +6 晓看天暮看云 2026-03-09 6/300 2026-03-14 01:16 by JourneyLucky
[考研] 271求调剂 +10 生如夏花… 2026-03-11 10/500 2026-03-14 00:35 by 卖报员小雨
[考研] 求调剂,一志愿江南大学环境工程085701 +3 Djdjj12 2026-03-10 4/200 2026-03-14 00:31 by JourneyLucky
[考研] 2026考研调剂+本科延边大学+山东大学+生物化学与分子生物学+有项目经验 +3 ccdsscjy 2026-03-10 3/150 2026-03-14 00:12 by JourneyLucky
[考研] 279求调剂 +3 抓着星星的女孩 2026-03-10 3/150 2026-03-13 23:47 by userper
[考研] 0703化学一志愿211 总分320求调剂 +5 玛卡巴卡啊哈 2026-03-11 5/250 2026-03-13 21:40 by JourneyLucky
[硕博家园] 深圳大学硕士招生(2026秋,传感器方向,仅录取第一志愿) +4 xujiaoszu 2026-03-11 7/350 2026-03-13 17:28 by xujiaoszu
[考研] 302求调剂 +6 负心者当诛 2026-03-11 6/300 2026-03-13 16:11 by JourneyLucky
[考研] 328化工专硕求调剂 +4 。,。,。,。i 2026-03-12 4/200 2026-03-13 14:44 by JourneyLucky
[考研] 085600材料与化工 309分请求调剂 +7 dtdxzxx 2026-03-12 8/400 2026-03-13 14:43 by jxchenghu
[考研] 材料301分求调剂 +5 Liyouyumairs 2026-03-12 5/250 2026-03-13 14:42 by JourneyLucky
[考研] 数二英二309分请求调剂 +3 dtdxzxx 2026-03-09 4/200 2026-03-09 19:56 by yuningshan
信息提示
请填处理意见