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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 各位学长、学姐帮帮忙，PCR只有引物二聚体
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韩元富豪

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by fuchange918 at 2014-05-06 15:58:56
如果是引物合成单上的退火温度的话，根据它给的退火温度减5度左右是很难P出来的，我一般用英俊合成引物，合成单上有两个Tm值，一个大的一个小的，我的一般都是大的那个Tm值减去10度多才能跑出目的片段，不知道你的这 ...

用pp5得到的Tm是64.3和65.6，加上酶切位点和保护碱基后，即引物合成单上的是67.2和65.6，该怎么确定退货温度呢
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11楼2014-05-06 18:02:02
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PCR-CL

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
扩增目的基因问题：
1、引物与要扩增序列的同源性？要在保守区设计。引物3端序列一定要完全匹配！
2、退火温度55就行。
3、模板加量约100ng\50ul体系。
4、扩增的聚合酶质量和性能要好。LATaq系列就行。
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12楼2014-05-06 21:37:47
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fuchange918

木虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 韩元富豪 at 2014-05-06 18:02:02
用pp5得到的Tm是64.3和65.6，加上酶切位点和保护碱基后，即引物合成单上的是67.2和65.6，该怎么确定退货温度呢...

你最好是在55度左右做的梯度PCR ,现在的PCR仪都可以设置梯度吧
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13楼2014-05-06 21:41:35
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pc012351

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
酶切位点和保护碱基不计算退火温度的，你这个估计五十几度的退火温度差不多了
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14楼2014-05-07 17:07:18
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ivyvampire

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

退火温度上下加减5度，跑个梯度PCR，模板引物量严格按照说明书（如果买的PCR mix)操作，如果还P不出来，应该是你那模板根本不对，或者你引物没设计好
好吧，我之前做实验，我导师给了我一个菌株，我一直P不出来，后来弄了一对引物，刚好扩出一点片段，但大小不对，我也拿去测序，结果发现他拿给我的菌株根本不是实验要用的菌株
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15楼2014-05-09 09:27:32
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快乐农夫

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

重新设计引物啊，你的引物的退火温度也太高了，延伸温度才72，你到底是退火呢还是延伸呢？引物能退火到模板上才怪呢，估计不是GC太多就是形成二级结构了，设计的时候保持在55度左右，而且两个引物之间的退火温度不要相差那么大，最多一两度，实在不行我给你设计个
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16楼2014-05-09 12:01:06
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曼舞流苏

新虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 快乐农夫 at 2014-05-09 12:01:06
重新设计引物啊，你的引物的退火温度也太高了，延伸温度才72，你到底是退火呢还是延伸呢？引物能退火到模板上才怪呢，估计不是GC太多就是形成二级结构了，设计的时候保持在55度左右，而且两个引物之间的退火温度不要 ...

好人你帮我设计一个吧。。我做的是人晶状体上皮细胞，目的蛋白是E-Cadherin。好人你若是看到了，帮我设计一个撒，不胜感激！！！
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17楼2015-03-09 16:30:18
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gnot_nail

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

内容已删除
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18楼2015-03-09 17:24:53
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

第一点，设计的引物完全不合理，那无论怎么扩增都是失败。其次，引物如果你认为还是合理的，但是摸索了条件，比如尝试了很多不同的温度，或镁离子浓度，还是只有引物二聚体的话，这时候就不应该在考虑引物有问题了，因为你在怎么优化还是扩增不出来。这时候，想想你提的模板是否有降解，模板降解了扩增出来的是非特异性产物，还有就是扩增使用的试剂，比如说酶，是否是质量太差，特异性太差，一般小于10kb的模板建议使用热启动酶，大于15kb的模板建议使用长片段高保真酶，如果你是在进行突变检测等高要求的实验，建议使用高保真甚至超保真聚合酶
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
19楼2015-03-10 10:57:40
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