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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 各位学长、学姐帮帮忙，PCR只有引物二聚体
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韩元富豪

金虫 (小有名气)

[求助] 各位学长、学姐帮帮忙，PCR只有引物二聚体 已有11人参与

设计的一对引物，Tm值分别是72℃、67.2℃，尝试的温度有66℃、65℃、64℃、63℃、62℃，但都只有引物二聚体，怎么办，（先前提模板DNA时有条带，但PCR的时候就只有引物二聚体了），已经做了好长时间了，怎么办，求指点
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1楼 2014-05-05 11:02:08
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

第一点，设计的引物完全不合理，那无论怎么扩增都是失败。其次，引物如果你认为还是合理的，但是摸索了条件，比如尝试了很多不同的温度，或镁离子浓度，还是只有引物二聚体的话，这时候就不应该在考虑引物有问题了，因为你在怎么优化还是扩增不出来。这时候，想想你提的模板是否有降解，模板降解了扩增出来的是非特异性产物，还有就是扩增使用的试剂，比如说酶，是否是质量太差，特异性太差，一般小于10kb的模板建议使用热启动酶，大于15kb的模板建议使用长片段高保真酶，如果你是在进行突变检测等高要求的实验，建议使用高保真甚至超保真聚合酶
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
19楼2015-03-10 10:57:40
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zep616745243

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-05 15:55:49
确保模板没有问题的前提下，可以试试降低退火温度吧，真不行就换引物吧
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只有不断地失败才会成功
2楼2014-05-05 12:26:24
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BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-05 15:55:56
你的模版是什么？基因组？
基因组DNA变性有点困难，可以考虑加DMSO。
把退火温度降到50度，看看有没有条带。如果没有条带果断换模版与引物。如果有带，继续优化PCR条件。
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3楼2014-05-05 12:34:25
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韩元富豪

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by BioChen at 2014-05-05 12:34:25
你的模版是什么？基因组？
基因组DNA变性有点困难，可以考虑加DMSO。
把退火温度降到50度，看看有没有条带。如果没有条带果断换模版与引物。如果有带，继续优化PCR条件。

模板是解淀粉芽孢杆菌中的pyrr基因，设计了两组引物：上游同源臂和下游同源臂，PCR的时候都只是引物二聚体，查看了这 个种的所有pyrr基因，在设计引物的那个片段，只有一个碱基不一样，其他都一样，下游同源臂引物未加被保护碱基和酶切位点的时候Tm是65.6和64.3，加了之后变成了72,67.2 。那Tm值多少合适呢
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4楼2014-05-05 14:28:12
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