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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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韩元富豪

金虫 (小有名气)

[求助] 各位学长、学姐帮帮忙,PCR只有引物二聚体 已有11人参与

设计的一对引物,Tm值分别是72℃、67.2℃,尝试的温度有66℃、65℃、64℃、63℃、62℃,但都只有引物二聚体,怎么办,(先前提模板DNA时有条带,但PCR的时候就只有引物二聚体了),已经做了好长时间了,怎么办,求指点
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sakor

铁虫 (初入文坛)

退火温度58至60差不多了
7楼2014-05-06 12:36:39
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查看全部 19 个回答

zep616745243

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-05-05 15:55:49
确保模板没有问题的前提下,可以试试降低退火温度吧,真不行就换引物吧
只有不断地失败才会成功
2楼2014-05-05 12:26:24
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BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-05-05 15:55:56
你的模版是什么?基因组?
基因组DNA变性有点困难,可以考虑加DMSO。
把退火温度降到50度,看看有没有条带。如果没有条带果断换模版与引物。如果有带,继续优化PCR条件。
3楼2014-05-05 12:34:25
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韩元富豪

金虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by BioChen at 2014-05-05 12:34:25
你的模版是什么?基因组?
基因组DNA变性有点困难,可以考虑加DMSO。
把退火温度降到50度,看看有没有条带。如果没有条带果断换模版与引物。如果有带,继续优化PCR条件。

模板是解淀粉芽孢杆菌中的pyrr基因,设计了两组引物:上游同源臂和下游同源臂,PCR的时候都只是引物二聚体,查看了这 个种的所有pyrr基因,在设计引物的那个片段,只有一个碱基不一样,其他都一样,下游同源臂引物未加被保护碱基和酶切位点的时候Tm是65.6和64.3,加了之后变成了72,67.2 。那Tm值多少合适呢
4楼2014-05-05 14:28:12
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