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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于荧光定量PCR引物设计的问题
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

[求助] 关于荧光定量PCR引物设计的问题

如题，我有一个疑问，就是我现在有一些转录组测序的序列，但是只是部分序列，还没有全长，但是我想QRT-PCR。设计引物时用测得的序列设计，但是总是没有完美的，有二聚体，有的有错配。扩出来效果不好，但是用primer5找不出好的，是不是我的序列只是部分的？还是这段序列没有符合荧光定量条件要求的引物位点？要是这样该怎么办啊？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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1楼 2013-11-28 23:58:26
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yang0071

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 鼓励发贴积极交流。 2013-11-29 13:11:51
lwk5716: 金币+7 2014-01-23 11:32:04
lwk5716: 金币+8, ★有帮助 2014-01-23 20:25:36
直接放弃比较好........................
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2楼2013-11-29 09:34:33
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yang0071 at 2013-11-29 09:34:33
直接放弃比较好........................

我做的是小麦的，没别的办法了吗？
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3楼2013-11-29 15:17:21
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yang0071 at 2013-11-29 09:34:33
直接放弃比较好........................

用什么方法替代荧光定量？半定量吗？谢谢你的回答。
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4楼2013-11-29 21:40:47
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)
我还有个问题是，有些试剂公司卖的sybr green试剂用两步法，既退火延伸合成一步了，但是不同引物的Tm值不同，这会不会有影响啊？
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5楼2013-12-26 16:20:35
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成功源于想像

铜虫 (小有名气)
做荧光定量最好用web primer这是网址：http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer。primer5有个缺点，不管怎么样都会出来引物，而web primer只有付合要求才能设计出引物，这样就要求自己选择合适的片段来设计引物，而这样设计出来的引物表现也是非常出色的~~另外不知道楼主的研究对象没有基因组信息，如果有建议进行外显子分区，然后将引物设计成跨外显子的。
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6楼2014-06-04 17:01:26
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 成功源于想像 at 2014-06-04 17:01:26
做荧光定量最好用web primer这是网址：http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer。primer5有个缺点，不管怎么样都会出来引物，而web primer只有付合要求才能设计出引物，这样就要求自己选择合适的片段来设计引 ...

谢谢你。
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7楼2014-06-06 21:26:22
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成功源于想像

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lwk5716 at 2013-12-26 16:20:35
我还有个问题是，有些试剂公司卖的sybr green试剂用两步法，既退火延伸合成一步了，但是不同引物的Tm值不同，这会不会有影响啊？

有影响，所以我们在设计引物时最好将不同基因的控制在相同范围，比如说都在59度到61度之间！

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8楼2014-06-08 23:50:13
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