应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求教一个关于荧光定量PCR的问题
71/1返回列表
查看: 1188  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

zhangyep121

铜虫 (小有名气)

[求助] 求教一个关于荧光定量PCR的问题

各位，在这里向大家请教关于PCR的问题，就是我要扩增一个1400bp的片段，用常规PCR扩增后，跑胶可以看到目的条带，可是用同样条件上荧光定量PCR的机器就看不到实时扩增曲线，请问大家是什么原因造成的呢，请大家各抒己见，谢谢！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-11-21 10:15:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhoulubin

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhangyep121: 金币+5, ★有帮助, 首先谢谢您的回答 2013-11-21 13:04:22
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-21 13:36:43
用Q-PCR跑1.4K的片段？我建议你温习一下Q-PCR基础理论知识
另外，以后不要用常规PCR去指导Q-PCR
赞一下 回复此楼
每个年龄都有其最应该做的事，但只有过了那个年龄自己才知道
2楼2013-11-21 11:25:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangyep121

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhoulubin at 2013-11-21 11:25:31
用Q-PCR跑1.4K的片段？我建议你温习一下Q-PCR基础理论知识
另外，以后不要用常规PCR去指导Q-PCR

我当然知道荧光定量PCR适合200bp以内的扩增，但是我希望能了解造成上述现象的原因，机理性的东西，设置1000多bpQPCR扩增也是有特殊原因的，希望得到深入的见解。
赞一下 回复此楼
3楼2013-11-21 13:07:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

junziwood

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
个人猜测或许是机器完成不了1.4kb的扩增吧，毕竟是qPCR。建议用RT-PCR。
赞一下 回复此楼
4楼2013-11-21 13:44:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Davidzjy

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhangyep121: 金币+10, ★★★很有帮助, 您的回答很有启发性，谢谢 2013-11-21 15:13:37
一般来说qPCR的扩增子要小于200bp
主要还是考虑到扩增效率和二级结构的问题
大部分的qPCR设备只提供30-60s的延长时间
另外 大片段的单链DNA在annealing的时候 可能出现分子内配对而导致出现二级结构 从而使得扩增失败
当然 也有些特别设计的试剂盒可以对超过200bp的序列进行qPCR
赞一下 回复此楼
5楼2013-11-21 13:50:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhangyep121: 金币+5, ★有帮助, 嗯，这方面实验已经做过了 2013-11-21 15:14:17
q-PCR与常规PCR的体系和酶不同，需要分别优化条件。我建议你做一个温度和模板浓度的梯度来优化一下PCR条件。
赞一下 回复此楼
6楼2013-11-21 13:51:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangyep121

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Davidzjy at 2013-11-21 13:50:28
一般来说qPCR的扩增子要小于200bp
主要还是考虑到扩增效率和二级结构的问题
大部分的qPCR设备只提供30-60s的延长时间
另外 大片段的单链DNA在annealing的时候 可能出现分子内配对而导致出现二级结构 从而使得扩增 ...

目前在荧光定量pcr仪的退火时间是90s，延伸30s，但是仍然没有效果
赞一下 回复此楼
7楼2013-11-21 15:15:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 zhangyep121 的主题更新
71/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭