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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求教一个关于荧光定量PCR的问题
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zhangyep121

铜虫 (小有名气)

[求助] 求教一个关于荧光定量PCR的问题

各位，在这里向大家请教关于PCR的问题，就是我要扩增一个1400bp的片段，用常规PCR扩增后，跑胶可以看到目的条带，可是用同样条件上荧光定量PCR的机器就看不到实时扩增曲线，请问大家是什么原因造成的呢，请大家各抒己见，谢谢！
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1楼 2013-11-21 10:15:14
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junziwood

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
个人猜测或许是机器完成不了1.4kb的扩增吧，毕竟是qPCR。建议用RT-PCR。
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4楼2013-11-21 13:44:24
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zhoulubin

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhangyep121: 金币+5, ★有帮助, 首先谢谢您的回答 2013-11-21 13:04:22
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-21 13:36:43
用Q-PCR跑1.4K的片段？我建议你温习一下Q-PCR基础理论知识
另外，以后不要用常规PCR去指导Q-PCR
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每个年龄都有其最应该做的事，但只有过了那个年龄自己才知道
2楼2013-11-21 11:25:31
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zhangyep121

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhoulubin at 2013-11-21 11:25:31
用Q-PCR跑1.4K的片段？我建议你温习一下Q-PCR基础理论知识
另外，以后不要用常规PCR去指导Q-PCR

我当然知道荧光定量PCR适合200bp以内的扩增，但是我希望能了解造成上述现象的原因，机理性的东西，设置1000多bpQPCR扩增也是有特殊原因的，希望得到深入的见解。
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3楼2013-11-21 13:07:29
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Davidzjy

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhangyep121: 金币+10, ★★★很有帮助, 您的回答很有启发性，谢谢 2013-11-21 15:13:37
一般来说qPCR的扩增子要小于200bp
主要还是考虑到扩增效率和二级结构的问题
大部分的qPCR设备只提供30-60s的延长时间
另外 大片段的单链DNA在annealing的时候 可能出现分子内配对而导致出现二级结构 从而使得扩增失败
当然 也有些特别设计的试剂盒可以对超过200bp的序列进行qPCR
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5楼2013-11-21 13:50:28
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