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handsomejjs

银虫 (初入文坛)

[求助] 酶切质粒是否可以不跑胶,直接纯化?已有8人参与

提出的质粒经常酶切不彻底,跑胶出现线形和环形两条带。

我的问题是,直接纯化,环形质粒是否会被线形过滤柱洗脱? 如果环形能被柱子分离,是否就可以直接纯化,不用跑胶了?

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cckk_2000

金虫 (小有名气)

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handsomejjs(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-11-30 15:47:51
handsomejjs: 金币+1 2014-12-09 05:30:32
handsomejjs: 金币+1, ★★★很有帮助 2014-12-09 05:30:40
纯化去除的是盐和酶之类的,DNA去除不了,跑胶就是为了分离未切和切开的,但是其实切不开有一个更好的解决办法,减少质粒的量,增加酶切时间。
科研炮灰
6楼2014-11-30 15:06:33
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sandancy123

捐助贵宾 (初入文坛)

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handsomejjs(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-11-30 15:48:00
handsomejjs: 金币+1, ★★★很有帮助 2014-12-09 05:30:46
如果你要回收的载体片段用做连接体系的话,不跑胶不行,不管你是单酶切还是双酶切,这样会降低你的连接效率,如果酶切的是pcr片段就可以直接不跑胶回收

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
7楼2014-11-30 15:40:06
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稻稻

铜虫 (著名写手)

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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-12-01 12:27:30
handsomejjs: 金币+1 2014-12-09 05:30:51
个人觉得酶切不彻底关系也不大,只要电泳能把条带区分开,把符合目的片段大小的条带切下来回收就可以啦。

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做一个不动声色的人,不准情绪化,不准回头看。
8楼2014-11-30 15:57:34
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喜气洋洋

金虫 (初入文坛)

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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-11-30 15:47:18
我这两天也在纠结这个问题中,以前做三个酶同时切都没出现跑胶拖尾的,这两天单酶切质粒跑胶几次都是酶切不完全或拖尾严重,好郁闷呀。今天又得重做了,朋友知道好建议了也和我分享一下哦

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学海无涯懂做舟
2楼2014-11-30 07:00:06
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

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handsomejjs: 金币+1, ★★★很有帮助 2014-12-09 05:30:05
酶切质粒必须切胶回收,否则后面都是空质粒。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
3楼2014-11-30 07:16:34
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xzy0425

新虫 (初入文坛)

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handsomejjs: 金币+1, ★★★很有帮助 2014-12-09 05:30:14
如果是单酶切,适当延长酶切时间,带充分酶切后,可以直接进行过柱回收;非单酶切,如果酶切位点很近也可以,否则不可以,只能进行切胶回收。
4楼2014-11-30 10:46:15
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Neo2000

木虫 (著名写手)

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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-11-30 15:47:43
handsomejjs: 金币+1, ★★★很有帮助 2014-12-09 05:30:21
少切点质粒就行了,然后直接过柱回收

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5楼2014-11-30 10:59:22
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hajierlove

铜虫 (正式写手)

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-30 23:04:44
handsomejjs: 金币+1, ★★★很有帮助 2014-12-09 05:30:57
建议酶切时间延长,酶切彻底,以前酶切2h还有没有切好的,现在酶切过夜,基本上都酶切彻底
踏实
9楼2014-11-30 21:59:53
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喜气洋洋

金虫 (初入文坛)

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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-12-01 12:27:37
今天验证了一下,单酶切,2.5h后,跑电泳与未酶切的环状DNA对比,的确线性比环状跑得慢一些,多跑一会儿完全可以分开

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学海无涯懂做舟
10楼2014-11-30 23:28:16
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