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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 克隆基因克隆不出来，请各位老师同学看看什么问题。
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秦始皇faq

铁虫 (初入文坛)

[求助] 克隆基因克隆不出来，请各位老师同学看看什么问题。 已有4人参与

各位老师好，本人今年研一，做的是同源基因克隆。师兄从NCBI查找的序列，设计了12对引物（12个功能结构域相似的基因），我用各种处理的（高温，低温，乙醇，盐）CDNA模板跑pcr，一共只有4对引物跑出了条带，但是大都与查找的序列不对应，我使用的是诺唯赞的mix酶。
回收条带后连接pud19-T载体，过夜培养后挑出单克隆，拿去测序，比对率都在25%左右。
不只是哪里出现了问题，跑PCR的时候就是按照师兄给的条件跑的：94  3min ;94 30s, 55 30s, 72 2min(30循环);4 正无穷。  

第一次发帖，也没什么经验，不知道说清楚没有，金币也没多少，所以还请各位老师同学见谅，帮帮我！
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1楼 2014-11-24 10:22:37
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zshw_001

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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秦始皇faq(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-24 19:11:04
估计和引物设计有关，引物特异性不强，容易扩出其他杂带的，blast一下引物。
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永远相信未知的总是美好的！
2楼2014-11-24 17:00:24
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秦始皇faq

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Beryl_xu at 2014-11-24 17:40:10
你这个才25%的正确率，也太低了吧。怀疑你用的模板就有问题，你是从文库里面PCR吧，很有可能没P出来。基因是什么？

模板用tubling扩了下都能扩出条带，基因是一类含有lysM结构域的和抗病相关的基因，模板就是用上面说的那四个条件处理后的簇毛麦提取的mRNA，反转录的cDNA。
我将扩出来的条带回收后连T载体，培养挑单克隆拿去测序的，今天拿到NCBI上blast，比对率高的都是什么菌什么菌的，反正没有和簇毛麦相关的东西。
接下来该怎么处理还请老师指点一下!
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5楼2014-11-24 20:28:46
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Beryl_xu

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
秦始皇faq(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-24 19:11:11
你这个才25%的正确率，也太低了吧。怀疑你用的模板就有问题，你是从文库里面PCR吧，很有可能没P出来。基因是什么？
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3楼2014-11-24 17:40:10
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秦始皇faq

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zshw_001 at 2014-11-24 17:00:24
估计和引物设计有关，引物特异性不强，容易扩出其他杂带的，blast一下引物。

引物是我师兄设计的，明天我BLAST一下看一下，但是问题是我的12对引物能扩出条带的只有4对，同样的条件下另外8对根本什么都没有，杂带也没有。扩出条带的四对引物大小也不是完全和目的基因大小相匹配的，一般都会比目的基因大。
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4楼2014-11-24 20:24:37
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枫林123

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

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秦始皇faq(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-11-25 13:16:46
测序结果比对不正确，估计是因为你引物设计的不特异，没有扩增出你的目的基因；也可能是因为你本身从NCBI上查找的序列就不正确，从而导致引物设计不正确。另外你其他的8个目的片段扩增没有条带，建议你提高一下退火温度。我之前用过诺唯赞的phanta mix酶，扩增效率挺高的，不知道你用的是不是这个酶。如果你的GC含量高的话可以加入Enhance，能够更好地扩增出目的片段。祝实验顺利
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6楼2014-11-25 09:29:27
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小木sigh

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-25 13:16:54
mRNA在体内的剪切方式可能跟你实际荡下来的序列不一致，所以你按荡下来的设计，可能本身就有问题
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7楼2014-11-25 10:37:14
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秦始皇faq

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 枫林123 at 2014-11-25 09:29:27
测序结果比对不正确，估计是因为你引物设计的不特异，没有扩增出你的目的基因；也可能是因为你本身从NCBI上查找的序列就不正确，从而导致引物设计不正确。另外你其他的8个目的片段扩增没有条带，建议你提高一下退火 ...

现在的退火温度是55度时间2min，老师您建议退回温度是多少比较合适？
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8楼2014-11-25 17:02:49
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秦始皇faq

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 枫林123 at 2014-11-25 09:29:27
测序结果比对不正确，估计是因为你引物设计的不特异，没有扩增出你的目的基因；也可能是因为你本身从NCBI上查找的序列就不正确，从而导致引物设计不正确。另外你其他的8个目的片段扩增没有条带，建议你提高一下退火 ...

刚看了下一下我的酶是诺唯赞的2xtaq master mix（dye plus）,我也不知道和您的有什么区别，我只是把那个管子上的文字照搬给你看了。。。。
另外，听我师兄说这个酶不是高保真酶，我用高保真酶什么都扩不出来，不知道是不是跟不是高保真酶有关心。
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9楼2014-11-25 17:06:40
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沐枫之城

新虫 (初入文坛)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-11-26 10:13:19
1.你这个PCR不需要终延伸么，怎么感觉程序里没有终延伸。
2.你的模板，也就是cDNA有没有跑琼脂糖检测过？
3.你做克隆完了之后至少拿菌落PCR检测下看看是不是有阳性克隆，有阳性克隆的话再送测。
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10楼2014-11-25 22:00:53
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