应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 克隆基因克隆不出来，请各位老师同学看看什么问题。
151/2返回列表12下一页
查看: 4396  |  回复: 14
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

秦始皇faq

铁虫 (初入文坛)

[求助] 克隆基因克隆不出来，请各位老师同学看看什么问题。 已有4人参与

各位老师好，本人今年研一，做的是同源基因克隆。师兄从NCBI查找的序列，设计了12对引物（12个功能结构域相似的基因），我用各种处理的（高温，低温，乙醇，盐）CDNA模板跑pcr，一共只有4对引物跑出了条带，但是大都与查找的序列不对应，我使用的是诺唯赞的mix酶。
回收条带后连接pud19-T载体，过夜培养后挑出单克隆，拿去测序，比对率都在25%左右。
不只是哪里出现了问题，跑PCR的时候就是按照师兄给的条件跑的：94  3min ;94 30s, 55 30s, 72 2min(30循环);4 正无穷。  

第一次发帖，也没什么经验，不知道说清楚没有，金币也没多少，所以还请各位老师同学见谅，帮帮我！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-11-24 10:22:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zshw_001

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
秦始皇faq(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-24 19:11:04
估计和引物设计有关，引物特异性不强，容易扩出其他杂带的，blast一下引物。
赞一下(1人) 回复此楼
永远相信未知的总是美好的！
2楼2014-11-24 17:00:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

秦始皇faq

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Beryl_xu at 2014-11-24 17:40:10
你这个才25%的正确率，也太低了吧。怀疑你用的模板就有问题，你是从文库里面PCR吧，很有可能没P出来。基因是什么？

模板用tubling扩了下都能扩出条带，基因是一类含有lysM结构域的和抗病相关的基因，模板就是用上面说的那四个条件处理后的簇毛麦提取的mRNA，反转录的cDNA。
我将扩出来的条带回收后连T载体，培养挑单克隆拿去测序的，今天拿到NCBI上blast，比对率高的都是什么菌什么菌的，反正没有和簇毛麦相关的东西。
接下来该怎么处理还请老师指点一下!
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2014-11-24 20:28:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

Beryl_xu

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
秦始皇faq(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-24 19:11:11
你这个才25%的正确率，也太低了吧。怀疑你用的模板就有问题，你是从文库里面PCR吧，很有可能没P出来。基因是什么？
赞一下 回复此楼
3楼2014-11-24 17:40:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

秦始皇faq

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zshw_001 at 2014-11-24 17:00:24
估计和引物设计有关，引物特异性不强，容易扩出其他杂带的，blast一下引物。

引物是我师兄设计的，明天我BLAST一下看一下，但是问题是我的12对引物能扩出条带的只有4对，同样的条件下另外8对根本什么都没有，杂带也没有。扩出条带的四对引物大小也不是完全和目的基因大小相匹配的，一般都会比目的基因大。
赞一下 回复此楼
4楼2014-11-24 20:24:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

枫林123

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
秦始皇faq(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-11-25 13:16:46
测序结果比对不正确，估计是因为你引物设计的不特异，没有扩增出你的目的基因；也可能是因为你本身从NCBI上查找的序列就不正确，从而导致引物设计不正确。另外你其他的8个目的片段扩增没有条带，建议你提高一下退火温度。我之前用过诺唯赞的phanta mix酶，扩增效率挺高的，不知道你用的是不是这个酶。如果你的GC含量高的话可以加入Enhance，能够更好地扩增出目的片段。祝实验顺利
赞一下 回复此楼
6楼2014-11-25 09:29:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小木sigh

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-25 13:16:54
mRNA在体内的剪切方式可能跟你实际荡下来的序列不一致，所以你按荡下来的设计，可能本身就有问题
赞一下 回复此楼
7楼2014-11-25 10:37:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

秦始皇faq

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 枫林123 at 2014-11-25 09:29:27
测序结果比对不正确，估计是因为你引物设计的不特异，没有扩增出你的目的基因；也可能是因为你本身从NCBI上查找的序列就不正确，从而导致引物设计不正确。另外你其他的8个目的片段扩增没有条带，建议你提高一下退火 ...

现在的退火温度是55度时间2min，老师您建议退回温度是多少比较合适？
赞一下 回复此楼
8楼2014-11-25 17:02:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

秦始皇faq

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 枫林123 at 2014-11-25 09:29:27
测序结果比对不正确，估计是因为你引物设计的不特异，没有扩增出你的目的基因；也可能是因为你本身从NCBI上查找的序列就不正确，从而导致引物设计不正确。另外你其他的8个目的片段扩增没有条带，建议你提高一下退火 ...

刚看了下一下我的酶是诺唯赞的2xtaq master mix（dye plus）,我也不知道和您的有什么区别，我只是把那个管子上的文字照搬给你看了。。。。
另外，听我师兄说这个酶不是高保真酶，我用高保真酶什么都扩不出来，不知道是不是跟不是高保真酶有关心。
赞一下 回复此楼
9楼2014-11-25 17:06:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

沐枫之城

新虫 (初入文坛)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-11-26 10:13:19
1.你这个PCR不需要终延伸么，怎么感觉程序里没有终延伸。
2.你的模板，也就是cDNA有没有跑琼脂糖检测过？
3.你做克隆完了之后至少拿菌落PCR检测下看看是不是有阳性克隆，有阳性克隆的话再送测。
赞一下 回复此楼
10楼2014-11-25 22:00:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 秦始皇faq 的主题更新
151/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 【2027博士申请】纳米药物递送方向 20+3 13586093586 2026-08-03 5/250 2026-08-08 21:54 by 13586093586
[基金申请] 2026国自然放榜时间 +3 布布和一二 2026-08-08 3/150 2026-08-08 18:15 by Lightingo
[基金申请] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 qTvzQBRAHjCi 2026-08-07 4/200 2026-08-08 17:22 by oEVWOejN9taj
[基金申请] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 qTvzQBRAHjCi 2026-08-07 5/250 2026-08-08 17:02 by oEVWOejN9taj
[论文投稿] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 qTvzQBRAHjCi 2026-08-07 4/200 2026-08-08 16:47 by oEVWOejN9taj
[基金申请] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 Vi50GxzrFcSG 2026-08-07 4/200 2026-08-08 16:19 by oEVWOejN9taj
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 Vi50GxzrFcSG 2026-08-07 5/250 2026-08-08 15:59 by oEVWOejN9taj
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 Vi50GxzrFcSG 2026-08-07 6/300 2026-08-08 15:07 by oEVWOejN9taj
[基金申请] fileCode有新解读？ +9 Tide man 2026-08-08 17/850 2026-08-08 14:56 by archvillain
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 HEQlVqMTIA7d 2026-08-07 6/300 2026-08-08 14:42 by oEVWOejN9taj
[基金申请] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 HEQlVqMTIA7d 2026-08-07 4/200 2026-08-08 14:27 by oEVWOejN9taj
[教师之家] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 KXLV3nuBVBY7 2026-08-07 5/250 2026-08-08 14:07 by oEVWOejN9taj
[基金申请] 关于filecode +4 布布和一二 2026-08-07 7/350 2026-08-07 22:55 by zhanghaozhu
[基金申请] 娱乐 +6 Tide man 2026-08-03 6/300 2026-08-07 22:40 by 铁帽子农民
[基金申请] 化学口download_prp&fileCode的固定段好像这几天一直没变，有变的大神么？ +3 Tide man 2026-08-07 4/200 2026-08-07 22:39 by Tide man
[基金申请] 听说今天filecode变了 +24 布布和一二 2026-08-06 47/2350 2026-08-07 16:02 by zhiyanjiang
[基金申请] filecode与中标关系的预测 +3 布布和一二 2026-08-07 3/150 2026-08-07 15:09 by gltch
[基金申请] filecode +8 布布和一二 2026-08-06 11/550 2026-08-06 20:41 by tangpu318
[基金申请] 好消息？这个有何含义？？？ +8 Tide man 2026-08-05 10/500 2026-08-05 16:14 by xmuxiaoyu
[基金申请] 面上提前没消息，有中的吗 +14 archvillain 2026-08-02 18/900 2026-08-04 14:42 by archvillain
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭