24小时热门版块排行榜

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

秦始皇faq

铁虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 1
帖子: 13
在线: 2.5小时
虫号: 3367823
注册: 2014-08-15
专业: 作物分子育种

[求助] 克隆基因克隆不出来，请各位老师同学看看什么问题。已有4人参与

各位老师好，本人今年研一，做的是同源基因克隆。师兄从NCBI查找的序列，设计了12对引物（12个功能结构域相似的基因），我用各种处理的（高温，低温，乙醇，盐）CDNA模板跑pcr，一共只有4对引物跑出了条带，但是大都与查找的序列不对应，我使用的是诺唯赞的mix酶。
回收条带后连接pud19-T载体，过夜培养后挑出单克隆，拿去测序，比对率都在25%左右。
不只是哪里出现了问题，跑PCR的时候就是按照师兄给的条件跑的：94 3min ;94 30s, 55 30s, 72 2min(30循环);4 正无穷。

第一次发帖，也没什么经验，不知道说清楚没有，金币也没多少，所以还请各位老师同学见谅，帮帮我！

回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

克隆目的基因的问题已经有15人回复
一个基因做TA克隆后送去测序，不同的单克隆后来结果不一致，1500bp里有的11个碱基不同已经有9人回复
克隆基因为什么一直连不到载体上已经有11人回复
求助分子克隆问题——挑不出阳性克隆！已经有14人回复
T载体克隆做不出来，求帮助已经有24人回复
基因克隆失败原因，求助！已经有10人回复
基因克隆转化表达遇到问题，求大神解答已经有14人回复
T-A克隆一直做不出来已经有28人回复
长片段基因3.9K克隆不出来，求助已经有43人回复
克隆做不出来，求帮助已经有19人回复
已知基因序列，要用PCR克隆该基因，模板从哪里来？已经有13人回复
克隆基因，挑克隆拿去测序，好多点突怎么办！？已经有21人回复
如何根据保守序列将基因片段克隆出来已经有16人回复
我有几个克隆和基因重组的基本问题不太清楚，请各位帮帮忙！已经有6人回复
我做的基因克隆，平行的几个克隆测序后，片段比对重叠率怎么不是100% 已经有5人回复
Ebook__《基因克隆和DNA分析》第四版中文版已经有422人回复
求助-基因克隆及引物设计的问题已经有6人回复
单个基因的克隆和表达可以发在什么杂志上已经有4人回复
克隆过程出现的问题已经有7人回复
基因克隆问题~~ 已经有5人回复
【求助/交流】基因做表达实验必须要克隆全长吗？已经有7人回复
【求助/交流】求助基因克隆方面的问题解决方案已经有17人回复
【求助/交流】已知基因序列如何克隆获得已经有18人回复

1楼 2014-11-24 10:22:37

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

秦始皇faq

铁虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 1
帖子: 13
在线: 2.5小时
虫号: 3367823
注册: 2014-08-15
专业: 作物分子育种

引用回帖:

6楼: Originally posted by 枫林123 at 2014-11-25 09:29:27
测序结果比对不正确，估计是因为你引物设计的不特异，没有扩增出你的目的基因；也可能是因为你本身从NCBI上查找的序列就不正确，从而导致引物设计不正确。另外你其他的8个目的片段扩增没有条带，建议你提高一下退火 ...

刚看了下一下我的酶是诺唯赞的2xtaq master mix（dye plus）,我也不知道和您的有什么区别，我只是把那个管子上的文字照搬给你看了。。。。
另外，听我师兄说这个酶不是高保真酶，我用高保真酶什么都扩不出来，不知道是不是跟不是高保真酶有关心。