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秦始皇faq

铁虫 (初入文坛)

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[求助] 克隆基因克隆不出来，请各位老师同学看看什么问题。已有4人参与

各位老师好，本人今年研一，做的是同源基因克隆。师兄从NCBI查找的序列，设计了12对引物（12个功能结构域相似的基因），我用各种处理的（高温，低温，乙醇，盐）CDNA模板跑pcr，一共只有4对引物跑出了条带，但是大都与查找的序列不对应，我使用的是诺唯赞的mix酶。
回收条带后连接pud19-T载体，过夜培养后挑出单克隆，拿去测序，比对率都在25%左右。
不只是哪里出现了问题，跑PCR的时候就是按照师兄给的条件跑的：94 3min ;94 30s, 55 30s, 72 2min(30循环);4 正无穷。

第一次发帖，也没什么经验，不知道说清楚没有，金币也没多少，所以还请各位老师同学见谅，帮帮我！

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1楼 2014-11-24 10:22:37

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枫林123

新虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
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秦始皇faq(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-11-25 13:16:46

测序结果比对不正确，估计是因为你引物设计的不特异，没有扩增出你的目的基因；也可能是因为你本身从NCBI上查找的序列就不正确，从而导致引物设计不正确。另外你其他的8个目的片段扩增没有条带，建议你提高一下退火温度。我之前用过诺唯赞的phanta mix酶，扩增效率挺高的，不知道你用的是不是这个酶。如果你的GC含量高的话可以加入Enhance，能够更好地扩增出目的片段。祝实验顺利