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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 克隆基因克隆不出来，请各位老师同学看看什么问题。
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枫林123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 秦始皇faq at 2014-11-25 17:06:40
刚看了下一下我的酶是诺唯赞的2xtaq master mix（dye plus）,我也不知道和您的有什么区别，我只是把那个管子上的文字照搬给你看了。。。。
另外，听我师兄说这个酶不是高保真酶，我用高保真酶什么都扩不出来，不知 ...

普通taq酶对模板的要求低一些，高保真酶对模板的要求相对高。普通的taq酶都没有扩增出来，可能是模板本身就有问题。
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11楼2014-11-26 10:02:12
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rgxabc

铁虫 (小有名气)
希望此贴不沉！
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致诚！致善！致精！致静！
12楼2014-11-26 14:12:39
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秦始皇faq

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 沐枫之城 at 2014-11-25 22:00:53
1.你这个PCR不需要终延伸么，怎么感觉程序里没有终延伸。
2.你的模板，也就是cDNA有没有跑琼脂糖检测过？
3.你做克隆完了之后至少拿菌落PCR检测下看看是不是有阳性克隆，有阳性克隆的话再送测。

我是个初学，很多还不太懂，请教老师什么是中延伸，是退火后面的那个温度吗，我的模板cdna用tubling引物跑过琼脂糖，有大小正确的带。不知道您说的跑琼脂糖检测是不是这个意思。还有我克隆玩的确是拿有阳性克隆的去测得，但是我所说的阳性克隆就是有条带，条带和开始做pcr时是一样的 ，但是和我目的基因片段大小对不上。
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13楼2014-11-26 16:07:34
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灰血动物

金虫 (小有名气)
我想问题是这样的。。。。


你师兄设计的引物是以基因组为模板的。。。。

而你实际使用的cDNA，因此二者序列压根就不一样。。。。。
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未完成
14楼2014-11-26 17:29:47
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沐枫之城

新虫 (初入文坛)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-11-27 20:07:58
引用回帖:
13楼: Originally posted by 秦始皇faq at 2014-11-26 16:07:34
我是个初学，很多还不太懂，请教老师什么是中延伸，是退火后面的那个温度吗，我的模板cdna用tubling引物跑过琼脂糖，有大小正确的带。不知道您说的跑琼脂糖检测是不是这个意思。还有我克隆玩的确是拿有阳性克隆的去 ...

那我就跟楼下意见比较一致了，有可能你引物设计的时候用基因组DNA，但是你扩增却用cDNA，就很难扩出来，即使扩出来也不特异。建议你再看看，然后根据cDNA序列设计下引物。(PS 终延伸指的就是循环后的那个退火问题，看你片段大小，一般5min就可以了)
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15楼2014-11-26 19:47:06
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