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枫林123

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 秦始皇faq at 2014-11-25 17:06:40
刚看了下一下我的酶是诺唯赞的2xtaq master mix(dye plus),我也不知道和您的有什么区别,我只是把那个管子上的文字照搬给你看了。。。。
另外,听我师兄说这个酶不是高保真酶,我用高保真酶什么都扩不出来,不知 ...

普通taq酶对模板的要求低一些,高保真酶对模板的要求相对高。普通的taq酶都没有扩增出来,可能是模板本身就有问题。
11楼2014-11-26 10:02:12
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rgxabc

铁虫 (小有名气)

希望此贴不沉!
致诚!致善!致精!致静!
12楼2014-11-26 14:12:39
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秦始皇faq

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
10楼: Originally posted by 沐枫之城 at 2014-11-25 22:00:53
1.你这个PCR不需要终延伸么,怎么感觉程序里没有终延伸。
2.你的模板,也就是cDNA有没有跑琼脂糖检测过?
3.你做克隆完了之后至少拿菌落PCR检测下看看是不是有阳性克隆,有阳性克隆的话再送测。

我是个初学,很多还不太懂,请教老师什么是中延伸,是退火后面的那个温度吗,我的模板cdna用tubling引物跑过琼脂糖,有大小正确的带。不知道您说的跑琼脂糖检测是不是这个意思。还有我克隆玩的确是拿有阳性克隆的去测得,但是我所说的阳性克隆就是有条带,条带和开始做pcr时是一样的 ,但是和我目的基因片段大小对不上。
13楼2014-11-26 16:07:34
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灰血动物

金虫 (小有名气)

我想问题是这样的。。。。


你师兄设计的引物是以基因组为模板的。。。。

而你实际使用的cDNA,因此二者序列压根就不一样。。。。。
未完成
14楼2014-11-26 17:29:47
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沐枫之城

新虫 (初入文坛)

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-11-27 20:07:58
引用回帖:
13楼: Originally posted by 秦始皇faq at 2014-11-26 16:07:34
我是个初学,很多还不太懂,请教老师什么是中延伸,是退火后面的那个温度吗,我的模板cdna用tubling引物跑过琼脂糖,有大小正确的带。不知道您说的跑琼脂糖检测是不是这个意思。还有我克隆玩的确是拿有阳性克隆的去 ...

那我就跟楼下意见比较一致了,有可能你引物设计的时候用基因组DNA,但是你扩增却用cDNA,就很难扩出来,即使扩出来也不特异。建议你再看看,然后根据cDNA序列设计下引物。(PS 终延伸指的就是循环后的那个退火问题,看你片段大小,一般5min就可以了)
15楼2014-11-26 19:47:06
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