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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 克隆基因克隆不出来，请各位老师同学看看什么问题。
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秦始皇faq

铁虫 (初入文坛)

[求助] 克隆基因克隆不出来，请各位老师同学看看什么问题。 已有4人参与

各位老师好，本人今年研一，做的是同源基因克隆。师兄从NCBI查找的序列，设计了12对引物（12个功能结构域相似的基因），我用各种处理的（高温，低温，乙醇，盐）CDNA模板跑pcr，一共只有4对引物跑出了条带，但是大都与查找的序列不对应，我使用的是诺唯赞的mix酶。
回收条带后连接pud19-T载体，过夜培养后挑出单克隆，拿去测序，比对率都在25%左右。
不只是哪里出现了问题，跑PCR的时候就是按照师兄给的条件跑的：94  3min ;94 30s, 55 30s, 72 2min(30循环);4 正无穷。  

第一次发帖，也没什么经验，不知道说清楚没有，金币也没多少，所以还请各位老师同学见谅，帮帮我！
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1楼 2014-11-24 10:22:37
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沐枫之城

新虫 (初入文坛)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-11-27 20:07:58
引用回帖:
13楼: Originally posted by 秦始皇faq at 2014-11-26 16:07:34
我是个初学，很多还不太懂，请教老师什么是中延伸，是退火后面的那个温度吗，我的模板cdna用tubling引物跑过琼脂糖，有大小正确的带。不知道您说的跑琼脂糖检测是不是这个意思。还有我克隆玩的确是拿有阳性克隆的去 ...

那我就跟楼下意见比较一致了，有可能你引物设计的时候用基因组DNA，但是你扩增却用cDNA，就很难扩出来，即使扩出来也不特异。建议你再看看，然后根据cDNA序列设计下引物。(PS 终延伸指的就是循环后的那个退火问题，看你片段大小，一般5min就可以了)
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15楼2014-11-26 19:47:06
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zshw_001

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
秦始皇faq(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-24 19:11:04
估计和引物设计有关，引物特异性不强，容易扩出其他杂带的，blast一下引物。
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永远相信未知的总是美好的！
2楼2014-11-24 17:00:24
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Beryl_xu

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
秦始皇faq(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-24 19:11:11
你这个才25%的正确率，也太低了吧。怀疑你用的模板就有问题，你是从文库里面PCR吧，很有可能没P出来。基因是什么？
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3楼2014-11-24 17:40:10
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秦始皇faq

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zshw_001 at 2014-11-24 17:00:24
估计和引物设计有关，引物特异性不强，容易扩出其他杂带的，blast一下引物。

引物是我师兄设计的，明天我BLAST一下看一下，但是问题是我的12对引物能扩出条带的只有4对，同样的条件下另外8对根本什么都没有，杂带也没有。扩出条带的四对引物大小也不是完全和目的基因大小相匹配的，一般都会比目的基因大。
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4楼2014-11-24 20:24:37
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