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秦始皇faq

铁虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 1
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虫号: 3367823
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专业: 作物分子育种

[求助] 克隆基因克隆不出来，请各位老师同学看看什么问题。已有4人参与

各位老师好，本人今年研一，做的是同源基因克隆。师兄从NCBI查找的序列，设计了12对引物（12个功能结构域相似的基因），我用各种处理的（高温，低温，乙醇，盐）CDNA模板跑pcr，一共只有4对引物跑出了条带，但是大都与查找的序列不对应，我使用的是诺唯赞的mix酶。
回收条带后连接pud19-T载体，过夜培养后挑出单克隆，拿去测序，比对率都在25%左右。
不只是哪里出现了问题，跑PCR的时候就是按照师兄给的条件跑的：94 3min ;94 30s, 55 30s, 72 2min(30循环);4 正无穷。

第一次发帖，也没什么经验，不知道说清楚没有，金币也没多少，所以还请各位老师同学见谅，帮帮我！

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1楼 2014-11-24 10:22:37

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沐枫之城

新虫 (初入文坛)

应助: 10 (幼儿园)
金币: 118.2
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在线: 97小时
虫号: 2495692
注册: 2013-06-04
专业: 作物分子育种

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-11-27 20:07:58

引用回帖:

13楼: Originally posted by 秦始皇faq at 2014-11-26 16:07:34
我是个初学，很多还不太懂，请教老师什么是中延伸，是退火后面的那个温度吗，我的模板cdna用tubling引物跑过琼脂糖，有大小正确的带。不知道您说的跑琼脂糖检测是不是这个意思。还有我克隆玩的确是拿有阳性克隆的去 ...

那我就跟楼下意见比较一致了，有可能你引物设计的时候用基因组DNA，但是你扩增却用cDNA，就很难扩出来，即使扩出来也不特异。建议你再看看，然后根据cDNA序列设计下引物。(PS 终延伸指的就是循环后的那个退火问题，看你片段大小，一般5min就可以了)