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750bp片段克隆 已有8人参与
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虫友们大家好！ 我就不卖关子了。我最近一直在做PCR，目的片段大约是750bp，体系如下：buffer~2ul，dNTPmix~1.6ul ,引物各0.5ul ，模板（cDNA）~2ul，酶~0.2ul，水~13.2ul,一起是20ul的体系， 酶是takara 的ExTaq, 程序：94 5min, 94 30s, annealing 30s, 72 45s, 35个cycles, 72 5min。 刚开始就按引物合成单上面的退火温度来做，结果只有100bp的引物二聚体，后来做了个温度梯度，结果还只有100bp的引物二聚体。上游引物是参考文献上面的，下游引物是软件设计的，上游引物18bp,下游引物19bp。求高手指导啊！先在此谢过大家了！本人金币不过，忘见谅！ |
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zhaodahe
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5楼2014-11-18 18:44:21
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【答案】应助回帖
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-18 22:50:58
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| 如果改变退火温度和其它条件都无效，也许需要换引物。不过觉得你循环数有点多，25到28应该就够了，循环数再多，产物也增加不了太多。模板一般加50ng（0.5ul左右）就不少了，你质粒什么浓度？你可以把模板质粒跑电泳估测浓度，Abs260对过高和过低浓度不准。引物是10uM的吧？别和100uM搞混。还有如果只是一个反应的话，可以把反应体系增加到50ul，否则蒸发一点，再挂壁一点，对反应体系影响大，而且体积太小不好加样，另外产物量也增加了。为获得更多PCR产物，我的经验是增加反应体积比过高提高循环数好。 |
3楼2014-11-18 18:40:27
4楼2014-11-18 18:41:34
