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丁香王子

铜虫 (初入文坛)

[交流] BP clonase II enzyme mix 多克隆连接 已有5人参与

谁用BP clonase II enzyme mix做过多克隆连接，我连接了两个月了还是连不上不知道什么原因，虫友们帮帮我，万分感谢！
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1楼 2012-11-05 09:46:00
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回帖置顶 ( 共有2个 )

starseacow

专家顾问 (职业作家)
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-06 17:18:41
丁香王子: 回帖置顶 2012-11-08 09:39:36
我一般使用体系为
1 微升 150微克/毫升 pDONR载体
1 微升 带有对应B位点的DNA片段（可以为PCR产物，或质粒，浓度在150微克/毫升以上）
0.5 微升 BP mix
混匀后室温放置一夜，取一微升转化TOP10细胞
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3楼2012-11-06 04:06:37
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丁香王子

铜虫 (初入文坛)
amisking: 回帖置顶 2012-11-08 20:23:44
引用回帖:
3楼: Originally posted by starseacow at 2012-11-06 04:06:37
我一般使用体系为
1 微升 150微克/毫升 pDONR载体
1 微升 带有对应B位点的DNA片段（可以为PCR产物，或质粒，浓度在150微克/毫升以上）
0.5 微升 BP mix
混匀后室温放置一夜，取一微升转化TOP10细胞

你好，非常感谢你的回复，我的B位点DNA片段大概是4kb，我用的5ulBP反应体系，B位点DNA片段的浓度和用量为1ul,20-60ng/ul.不知道用量是否有点少，连接时间为16h,l连接产物取1ul热击法转入50ulDH5α感受态中，最终平板上长出的菌落数只有几个检测也不是目的entry clone，不知道我上面的操作方法有没有什么问题还请你指出，我现在想尝试一下电击转化，因为我觉得问题可能在转化上了。还请你给出意见和建议。
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4楼2012-11-08 11:07:40
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普通回帖

stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
★
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增加PCR产物及pDONR的用量，延长反应时间。
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2楼2012-11-05 12:49:19
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starseacow

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4楼: Originally posted by 丁香王子 at 2012-11-08 11:07:40
你好，非常感谢你的回复，我的B位点DNA片段大概是4kb，我用的5ulBP反应体系，B位点DNA片段的浓度和用量为1ul,20-60ng/ul.不知道用量是否有点少，连接时间为16h,l连接产物取1ul热击法转入50ulDH5α感受态中，最终平 ...

首先你得确认使用的B位点正确且对应，其次DNA片段我感觉浓度偏低，你可以试试增大用量，在体系中用2微升试试，最后就是转化细胞，你有什么阳性对照可以用来确认感受态细胞正常工作么？
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5楼2012-11-08 17:06:40
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丁香王子

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by starseacow at 2012-11-08 17:06:40
首先你得确认使用的B位点正确且对应，其次DNA片段我感觉浓度偏低，你可以试试增大用量，在体系中用2微升试试，最后就是转化细胞，你有什么阳性对照可以用来确认感受态细胞正常工作么？...

我是买的感受态细胞，可以用买的感受态里带的质粒做阳性对照吗？
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6楼2012-11-08 22:35:04
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starseacow

专家顾问 (职业作家)
★
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6楼: Originally posted by 丁香王子 at 2012-11-08 22:35:04
我是买的感受态细胞，可以用买的感受态里带的质粒做阳性对照吗？...

没用过，不过应该可以
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7楼2012-11-09 03:20:49
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wangcaijuan

铁虫 (初入文坛)
★
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楼主最近做出来了吗？我最近也在做这个的克隆，真是各种烦心啊，做不出来！
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8楼2013-02-06 13:24:38
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匿名

★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖仅楼主可见
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9楼2015-04-13 16:37:01
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繁梦倾城

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我想问问楼主在哪买的BP clonase II enzyme mix，还有买20 reactions够用吗，能够分享一下吗，万分谢谢

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10楼2020-09-07 09:18:01
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