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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 带酶切位点的片段连接平末端载体后，还能从平末端载体上酶切下来吗？
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)

[求助] 带酶切位点的片段连接平末端载体后，还能从平末端载体上酶切下来吗？ 已有1人参与

用高保真扩一个3000的片段，然后要酶切连表达载体。
  想了一个办法觉得比较省事，但不知道可不可行，请大家帮我看看：
  我用带酶切位点的引物扩增我的目的片段，扩增出来的片段就应该是带有酶切位点的片段，末端是平末端。然后我连接平末端载体，由于片段上已经带有酶切位点，我再用酶把这个片段切下来，连接表达载体。
  当然更省事的办法是直接连表达载体，但是之前实验室同门做过，测序结果不好。
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1楼 2014-11-11 10:12:24
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yudaoqian88

至尊木虫 (知名作家)

不良人

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
ggyy0911: 金币+3, ★★★很有帮助, 好的，那我知道了～ 2014-11-11 12:08:12
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-11 16:35:43
引用回帖:
3楼: Originally posted by ggyy0911 at 2014-11-11 10:42:34
我用的平末端连接效率还不错，几乎百发百中。我看的文献也少，总觉得这么做不合常理，通常应该是不带酶切位点连克隆载体，测序，再用带酶切位点p下来，然后连接表达，再测序。真的是知其然不知其所以然。
...

通常是这样，为了增加特异性扩增，有时候直接用带有酶切位点的引物扩基因组也是可以的！或者大都这么干…不想费事…

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特别喜欢家门口开门的瞬间，宝宝那个高兴呀，蹦蹦跳跳，好不热闹！
4楼2014-11-11 10:48:23
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yudaoqian88

至尊木虫 (知名作家)

不良人

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-11 16:35:35
就是应该这样做呀？连到克隆载体上才方便后续操作…不过平末端貌似没有一般的TA克隆效率低！

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特别喜欢家门口开门的瞬间，宝宝那个高兴呀，蹦蹦跳跳，好不热闹！
2楼2014-11-11 10:22:39
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yudaoqian88 at 2014-11-11 10:22:39
就是应该这样做呀？连到克隆载体上才方便后续操作…不过平末端貌似没有一般的TA克隆效率低！

我用的平末端连接效率还不错，几乎百发百中。我看的文献也少，总觉得这么做不合常理，通常应该是不带酶切位点连克隆载体，测序，再用带酶切位点p下来，然后连接表达，再测序。真的是知其然不知其所以然。

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3楼2014-11-11 10:42:34
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yudaoqian88 at 2014-11-11 10:48:23
通常是这样，为了增加特异性扩增，有时候直接用带有酶切位点的引物扩基因组也是可以的！或者大都这么干…不想费事…
...

好的，那我知道了～

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5楼2014-11-11 12:07:51
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