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zsykk123

金虫 (正式写手)

[求助] 求助:载体用Nhe1和Sma1双酶切,片段用Nhe1单酶切,两者能连上吗?

如题:我实验用的载体用Nhe1和Sma1双酶切,设计引物上游引物含有Nhe1酶切位点,下游引物含有Hind酶切位点,用该引物PCR扩增得到的片段,用Nhe1单酶切,最后将载体与片段进行连接,请问能连上吗?
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my
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
zsykk123: 金币+8, 有帮助 2013-08-15 13:39:40
gyesang: 金币+2, 正解! 2013-08-15 16:34:27
gyesang: 回帖置顶 2013-08-15 16:34:31
一端粘性末端,一端是平末端,能连上的,前提是PCR不能用Taq酶,必须用高保真的Pfu等,否则3'端多了个A,不是平末端。
4楼2013-08-15 13:29:22
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普通回帖

wallflowere

新虫 (正式写手)

连不上!
你在载体上选择的酶切位点和引物设计的酶切位点要一致
2楼2013-08-15 10:12:39
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zsykk123

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by wallflowere at 2013-08-15 10:12:39
连不上!
你在载体上选择的酶切位点和引物设计的酶切位点要一致

载体中Sma1酶切后是平端的,片段最后只用Nhe1切
my
3楼2013-08-15 10:57:41
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zsykk123

金虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by lxj341401 at 2013-08-15 13:29:22
一端粘性末端,一端是平末端,能连上的,前提是PCR不能用Taq酶,必须用高保真的Pfu等,否则3'端多了个A,不是平末端。

谢谢,是的我就想再次确认这样是否能连上。不过它比普通的两黏端连接要难些对吧,请问你做这样的连接有什么好的办法或注意事项吗?
my
5楼2013-08-15 13:39:16
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-08-15 16:34:41
引用回帖:
5楼: Originally posted by zsykk123 at 2013-08-15 13:39:16
谢谢,是的我就想再次确认这样是否能连上。不过它比普通的两黏端连接要难些对吧,请问你做这样的连接有什么好的办法或注意事项吗?...

确实要难点,基因和载体的浓度尽量高点,另外加点聚乙二醇有助于连接。
6楼2013-08-15 15:59:19
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跳舞的骆驼

金虫 (初入文坛)

如果感受态的效率高些会增大几率
7楼2013-08-15 16:32:12
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