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zsykk123

金虫 (正式写手)

[求助] 求助：载体用Nhe1和Sma1双酶切，片段用Nhe1单酶切，两者能连上吗？

如题：我实验用的载体用Nhe1和Sma1双酶切，设计引物上游引物含有Nhe1酶切位点，下游引物含有Hind酶切位点，用该引物PCR扩增得到的片段，用Nhe1单酶切，最后将载体与片段进行连接，请问能连上吗？
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ｍｙ
1楼 2013-08-15 10:02:27
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wallflowere

新虫 (正式写手)
连不上！
你在载体上选择的酶切位点和引物设计的酶切位点要一致
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2楼2013-08-15 10:12:39
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zsykk123

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wallflowere at 2013-08-15 10:12:39
连不上！
你在载体上选择的酶切位点和引物设计的酶切位点要一致

载体中Sma1酶切后是平端的，片段最后只用Nhe1切
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ｍｙ
3楼2013-08-15 10:57:41
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zsykk123: 金币+8, ★有帮助 2013-08-15 13:39:40
gyesang: 金币+2, 正解！ 2013-08-15 16:34:27
gyesang: 回帖置顶 2013-08-15 16:34:31
一端粘性末端，一端是平末端，能连上的，前提是PCR不能用Taq酶，必须用高保真的Pfu等，否则3'端多了个A，不是平末端。
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4楼2013-08-15 13:29:22
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zsykk123

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lxj341401 at 2013-08-15 13:29:22
一端粘性末端，一端是平末端，能连上的，前提是PCR不能用Taq酶，必须用高保真的Pfu等，否则3'端多了个A，不是平末端。

谢谢，是的我就想再次确认这样是否能连上。不过它比普通的两黏端连接要难些对吧，请问你做这样的连接有什么好的办法或注意事项吗？
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ｍｙ
5楼2013-08-15 13:39:16
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-15 16:34:41
引用回帖:
5楼: Originally posted by zsykk123 at 2013-08-15 13:39:16
谢谢，是的我就想再次确认这样是否能连上。不过它比普通的两黏端连接要难些对吧，请问你做这样的连接有什么好的办法或注意事项吗？...

确实要难点，基因和载体的浓度尽量高点，另外加点聚乙二醇有助于连接。
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6楼2013-08-15 15:59:19
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跳舞的骆驼

金虫 (初入文坛)
如果感受态的效率高些会增大几率
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7楼2013-08-15 16:32:12
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