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金虫 (正式写手)

[求助] 求助：载体用Nhe1和Sma1双酶切，片段用Nhe1单酶切，两者能连上吗？

如题：我实验用的载体用Nhe1和Sma1双酶切，设计引物上游引物含有Nhe1酶切位点，下游引物含有Hind酶切位点，用该引物PCR扩增得到的片段，用Nhe1单酶切，最后将载体与片段进行连接，请问能连上吗？

ｍｙ

1楼 2013-08-15 10:02:27

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金虫 (正式写手)

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2楼: Originally posted by wallflowere at 2013-08-15 10:12:39
连不上！
你在载体上选择的酶切位点和引物设计的酶切位点要一致

载体中Sma1酶切后是平端的，片段最后只用Nhe1切

ｍｙ

3楼2013-08-15 10:57:41

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金虫 (正式写手)

引用回帖:

4楼: Originally posted by lxj341401 at 2013-08-15 13:29:22
一端粘性末端，一端是平末端，能连上的，前提是PCR不能用Taq酶，必须用高保真的Pfu等，否则3'端多了个A，不是平末端。

谢谢，是的我就想再次确认这样是否能连上。不过它比普通的两黏端连接要难些对吧，请问你做这样的连接有什么好的办法或注意事项吗？

ｍｙ

5楼2013-08-15 13:39:16

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