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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » BamHI,SmaI平末端粘性末端连接问题
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lyyjackey

新虫 (小有名气)

[求助] BamHI,SmaI平末端粘性末端连接问题

最近一直在做工程菌构建问题，我的目的片段大约在1000bp左右，载体为7000左右，分别采用BamHI和SmaI对质粒和载体进行双酶切，片段是连到T载体上的，测序正确。PS:酶切位点不能更换了。
    分别双酶切后，割胶后胶回收。
连接体系如下：
片段：4uL
载体：1uL
连接酶：1uL（PS：TAKARA的solutionI连接酶）
在金属浴上16度连接过夜，转化JM109感受态。

感受态之前构建的连T载体转化效率都很高，目前还是在用同一批感受态。
已经做了近一个多月了，一直是平板上什么都没有，空空如也。
实验做得已不知所措，希望有这方面经验的可以耐心予以解答，感激不尽。
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1楼 2013-11-22 15:58:42
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lyyjackey

新虫 (小有名气)
不好意思。上面的连接体系中solutionI:5uL
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2楼2013-11-22 16:00:41
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远方tony

新虫 (初入文坛)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-22 16:27:27
是什么载体，载体的抗性查对了吗？别把板子的抗性弄错了。
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把没学的都补回来。
3楼2013-11-22 16:06:56
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zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-11-22 22:12:55
平末端是效率低些，也不至于一个斑也没有吧，转化时建议做好阳性对照，证实感受态是好的，确认你的连接片段有东西，胶回收有的时候没回收到，再做一次，如果不行，建议从头开始，重新设计引物，用合适的酶切位点，一个月没做出来载体，有点长了，这种实验一个星期就该做好。
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4楼2013-11-22 19:12:05
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脱水拂空

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-11-22 22:13:02
你可以换一下T4连接酶可能效果会好些
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5楼2013-11-22 21:28:59
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lyyjackey

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 远方tony at 2013-11-22 16:06:56
是什么载体，载体的抗性查对了吗？别把板子的抗性弄错了。

是一个穿梭质粒，不是很常用的，抗性是没错的，氨苄抗性
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6楼2013-11-24 07:51:32
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lyyjackey

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zh10246 at 2013-11-22 19:12:05
平末端是效率低些，也不至于一个斑也没有吧，转化时建议做好阳性对照，证实感受态是好的，确认你的连接片段有东西，胶回收有的时候没回收到，再做一次，如果不行，建议从头开始，重新设计引物，用合适的酶切位点，一 ...

对照是直接转空质粒的，结果是满板的菌，说明平板应该是没有问题的了。
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7楼2013-11-24 07:52:13
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overhalfmoon

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-24 21:16:45
请把切完的质粒和片段都跑一下胶。我前两周遇到的问题和你一样，用的thermo的FD sma1，最后发现这个酶竟然会把质粒完全消化掉

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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8楼2013-11-24 08:25:52
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anning529

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
9楼2013-11-24 20:17:35
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alicelchf

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-11-24 21:16:57
换T4 ligase
另外检测下你酶切回收的效果
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修身、齐家、治国、平天下
10楼2013-11-24 20:39:06
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