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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » BamHI,SmaI平末端粘性末端连接问题
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lyyjackey

新虫 (小有名气)

[求助] BamHI,SmaI平末端粘性末端连接问题

最近一直在做工程菌构建问题，我的目的片段大约在1000bp左右，载体为7000左右，分别采用BamHI和SmaI对质粒和载体进行双酶切，片段是连到T载体上的，测序正确。PS:酶切位点不能更换了。
    分别双酶切后，割胶后胶回收。
连接体系如下：
片段：4uL
载体：1uL
连接酶：1uL（PS：TAKARA的solutionI连接酶）
在金属浴上16度连接过夜，转化JM109感受态。

感受态之前构建的连T载体转化效率都很高，目前还是在用同一批感受态。
已经做了近一个多月了，一直是平板上什么都没有，空空如也。
实验做得已不知所措，希望有这方面经验的可以耐心予以解答，感激不尽。
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1楼 2013-11-22 15:58:42
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lyyjackey

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 远方tony at 2013-11-22 16:06:56
是什么载体，载体的抗性查对了吗？别把板子的抗性弄错了。

是一个穿梭质粒，不是很常用的，抗性是没错的，氨苄抗性
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6楼2013-11-24 07:51:32
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lyyjackey

新虫 (小有名气)
不好意思。上面的连接体系中solutionI:5uL
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2楼2013-11-22 16:00:41
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远方tony

新虫 (初入文坛)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-22 16:27:27
是什么载体，载体的抗性查对了吗？别把板子的抗性弄错了。
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把没学的都补回来。
3楼2013-11-22 16:06:56
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zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-11-22 22:12:55
平末端是效率低些，也不至于一个斑也没有吧，转化时建议做好阳性对照，证实感受态是好的，确认你的连接片段有东西，胶回收有的时候没回收到，再做一次，如果不行，建议从头开始，重新设计引物，用合适的酶切位点，一个月没做出来载体，有点长了，这种实验一个星期就该做好。
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4楼2013-11-22 19:12:05
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