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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 怎么优化PCR体系
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惊叹号

金虫 (正式写手)

[求助] 怎么优化PCR体系 已有2人参与

目的片段：1200bp
反应体系：cDNA:1ug    引物浓度：250nmol/l      氯化镁：1.5mmol/l       Taq酶：0.5U      dNTP:200umol/l
循环体系：95℃，5min;        95℃,30s;          44℃~52℃:30s;        72℃:1min30s
引物给出的Tm值最小为49℃，我58℃、60℃都跑过，但是结果都是只有引物二聚体。
引物为师兄帮忙设计，老板说没问题，上下游引物中都含有TTAATTAA酶切位点。
请教各位高手，体系还需要怎么优化？
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1楼 2014-10-31 12:36:14
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厚德求是

木虫 (著名写手)

Ph. D. Prof.
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
内容已删除
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2楼2014-10-31 13:38:11
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匿名
本帖仅楼主可见
3楼2014-10-31 13:47:34
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synbio

新虫 (初入文坛)
试一下47℃退火。
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4楼2014-10-31 14:15:16
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hajierlove

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
惊叹号: 金币+20, ★有帮助 2014-10-31 22:03:41
cDNA1ug吗？还是1ul，1ul太多了，20ng就可以p出来了，你的时间可以设一个梯度，从45左右到60
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踏实
5楼2014-10-31 20:08:31
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惊叹号

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by synbio at 2014-10-31 14:15:16
试一下47℃退火。

我用梯度PCR44℃、46℃、48℃、50℃、52℃，包括58℃、60℃我都试过了，而且有一个问题就是，温度越高，感觉引物二聚体越明显。
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6楼2014-10-31 22:02:45
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惊叹号

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by hajierlove at 2014-10-31 20:08:31
cDNA1ug吗？还是1ul，1ul太多了，20ng就可以p出来了，你的时间可以设一个梯度，从45左右到60

cDNA在0.1-2ug之间应该都是没问题的，梯度我设过了，从44℃到52℃，包括58℃、60℃都设过。
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7楼2014-10-31 22:05:08
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ...
感谢参与，应助指数 +1
惊叹号: 金币+20, ★有帮助, 184484345 2014-11-01 08:49:20
惊叹号: 金币+280, ★★★★★最佳答案, 非常感谢 2014-11-01 10:50:05
你这个很难说哪里没问题，留下QQ聊吧，我帮你分析下。

[ 发自小木虫客户端 ]
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8楼2014-10-31 22:31:12
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刘芬玲

金虫 (初入文坛)
引物Tm值太低了吧，降低退火温度，还有buffer 和镁离子分开的话，调节一下镁离子浓度，我们以前的实验就是受镁离子农奴度影响的，其他的我也暂时没想到
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惊叹号
9楼2014-11-01 11:34:10
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惊叹号

金虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
9楼: Originally posted by 刘芬玲 at 2014-11-01 11:34:10
引物Tm值太低了吧，降低退火温度，还有buffer 和镁离子分开的话，调节一下镁离子浓度，我们以前的实验就是受镁离子农奴度影响的，其他的我也暂时没想到

我做过阳性对照，很清晰的一条带，所以镁离子浓度是没问题的。
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10楼2014-11-01 15:50:51
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