应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 怎么优化PCR体系
353/4返回列表上一页1234下一页
查看: 2270  |  回复: 34
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

zhang3shan

金虫 (初入文坛)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-03 22:53:16
引物梯度，循环数梯度，Mg离子浓度梯度，模板量体度，酶量梯度方面试试
赞一下 回复此楼
star
21楼2014-11-03 22:49:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hihe99

银虫 (小有名气)
引用回帖:
20楼: Originally posted by hajierlove at 2014-11-03 23:00:05
我的一个基因扩全长，引物不好，一直扩不出来，有发夹结构，温度梯度，模板量，touch down都试了，没有目的条带，只有引物二聚体，明天按你的跑一下，试试...

我感觉两步法还是要引物TM值高些才能有效，
你的模版检测过没，有没有问题？
赞一下 回复此楼
22楼2014-11-04 11:49:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小花猫阿

新虫 (小有名气)
你可以在前几个退火循环里调整一个比较合适的较低的退火温度先进行特异性扩增，减少非特异性扩增，然后再升高退火温度进行接下来的退火循环，看看如何。
赞一下 回复此楼
23楼2014-11-04 12:21:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小花猫阿

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 惊叹号 at 2014-10-31 22:02:45
我用梯度PCR44℃、46℃、48℃、50℃、52℃，包括58℃、60℃我都试过了，而且有一个问题就是，温度越高，感觉引物二聚体越明显。...

对呀，所以你可以按我说的，找个较低的退火温度循环几次，增加特异性数目，然后再提高退火温度就可以了呀
赞一下 回复此楼
24楼2014-11-04 12:23:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小花猫阿

新虫 (小有名气)
引用回帖:
24楼: Originally posted by 小花猫阿 at 2014-11-04 12:23:01
对呀，所以你可以按我说的，找个较低的退火温度循环几次，增加特异性数目，然后再提高退火温度就可以了呀...

温度越高，非特异性越多，所以一定要在低的退火温度循环时进行特异性富集，再升高退火温度进行循环
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

惊叹号
25楼2014-11-04 12:26:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

惊叹号

金虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
16楼: Originally posted by hihe99 at 2014-11-03 13:14:39
温度越高引物二聚体越多可能是因为温度高就有多的引物没有结合到模版上去反应，最后形成了二聚体。不知道你的引物长度多少，是不是5’端加了酶切位点什么的，说的引物的信息太少，没法判断，要不试试降落pcr吧

谢谢，重新换了引物，现在已经P出来了。
赞一下 回复此楼
26楼2014-11-05 21:45:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

惊叹号

金虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
19楼: Originally posted by 古木宁天 at 2014-11-03 21:18:30
有的，我有时会用这个体系扩片段。...

引物的问题，现在已经P出来了。
赞一下 回复此楼
27楼2014-11-05 21:46:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

惊叹号

金虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
20楼: Originally posted by hajierlove at 2014-11-03 22:00:05
我的一个基因扩全长，引物不好，一直扩不出来，有发夹结构，温度梯度，模板量，touch down都试了，没有目的条带，只有引物二聚体，明天按你的跑一下，试试...

再换引物试试。
回复此楼
28楼2014-11-05 21:47:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

惊叹号

金虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
25楼: Originally posted by 小花猫阿 at 2014-11-04 12:26:36
温度越高，非特异性越多，所以一定要在低的退火温度循环时进行特异性富集，再升高退火温度进行循环...

谢谢
回复此楼
29楼2014-11-05 21:48:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hajierlove

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
22楼: Originally posted by hihe99 at 2014-11-04 11:49:30
我感觉两步法还是要引物TM值高些才能有效，
你的模版检测过没，有没有问题？...

模板没有问题，同时试了两个基因，另一个做出来了，引物tm不高啊50左右，怎么办？还有什么意见吗？
赞一下 回复此楼
踏实
30楼2014-11-05 22:20:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 惊叹号 的主题更新
353/4返回列表上一页1234下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 2rKfVQg2jQww 2026-11-06 5/250 2026-11-07 17:34 by Xc2FxHsHkBNc
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 5/250 2026-11-07 17:01 by Xc2FxHsHkBNc
[教师之家] 延安大学回应“副教授留绝笔信”：确已离世，正核实举报内容 +3 yexuqing 2026-11-04 5/250 2026-11-07 13:22 by 苏东坡二世
[公派出国] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +8 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 23/1150 2026-11-07 06:49 by Equinoxhua
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +10 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 22/1100 2026-11-06 17:18 by 5sJFDKp2kwuI
[公派出国] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-05 5/250 2026-11-06 16:43 by 5sJFDKp2kwuI
[考博] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +6 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-05 8/400 2026-11-06 16:34 by 5sJFDKp2kwuI
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 10/500 2026-11-06 16:23 by 5sJFDKp2kwuI
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +7 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 14/700 2026-11-06 13:47 by BkA9Bi5cMhkD
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +7 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 17/850 2026-11-06 13:47 by BkA9Bi5cMhkD
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +6 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 11/550 2026-11-06 13:47 by BkA9Bi5cMhkD
[硕博家园] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-05 5/250 2026-11-06 09:01 by 2lRNluKrJpwL
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 10/500 2026-11-06 05:32 by qL1cU46YIdK0
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 kvewwGtKktqB 2026-11-04 11/550 2026-11-06 05:10 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +6 kvewwGtKktqB 2026-11-04 16/800 2026-11-06 05:00 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 8/400 2026-11-06 02:24 by qL1cU46YIdK0
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 9/450 2026-11-06 02:15 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 9/450 2026-11-06 02:02 by qL1cU46YIdK0
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 12/600 2026-11-05 11:10 by PYZmcHr5kSaq
[基金申请] 各位基础老师们，看完中央《从严治党》的决定后，对学术界更加有信心了吧 +5 iaeyuan 2026-11-01 5/250 2026-11-04 14:43 by jinchengzi
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭