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zhang3shan

金虫 (初入文坛)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-03 22:53:16
引物梯度，循环数梯度，Mg离子浓度梯度，模板量体度，酶量梯度方面试试
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star
21楼2014-11-03 22:49:53
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hihe99

银虫 (小有名气)
引用回帖:
20楼: Originally posted by hajierlove at 2014-11-03 23:00:05
我的一个基因扩全长，引物不好，一直扩不出来，有发夹结构，温度梯度，模板量，touch down都试了，没有目的条带，只有引物二聚体，明天按你的跑一下，试试...

我感觉两步法还是要引物TM值高些才能有效，
你的模版检测过没，有没有问题？
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22楼2014-11-04 11:49:30
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小花猫阿

新虫 (小有名气)
你可以在前几个退火循环里调整一个比较合适的较低的退火温度先进行特异性扩增，减少非特异性扩增，然后再升高退火温度进行接下来的退火循环，看看如何。
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23楼2014-11-04 12:21:38
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小花猫阿

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 惊叹号 at 2014-10-31 22:02:45
我用梯度PCR44℃、46℃、48℃、50℃、52℃，包括58℃、60℃我都试过了，而且有一个问题就是，温度越高，感觉引物二聚体越明显。...

对呀，所以你可以按我说的，找个较低的退火温度循环几次，增加特异性数目，然后再提高退火温度就可以了呀
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24楼2014-11-04 12:23:01
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小花猫阿

新虫 (小有名气)
引用回帖:
24楼: Originally posted by 小花猫阿 at 2014-11-04 12:23:01
对呀，所以你可以按我说的，找个较低的退火温度循环几次，增加特异性数目，然后再提高退火温度就可以了呀...

温度越高，非特异性越多，所以一定要在低的退火温度循环时进行特异性富集，再升高退火温度进行循环
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惊叹号
25楼2014-11-04 12:26:36
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惊叹号

金虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
16楼: Originally posted by hihe99 at 2014-11-03 13:14:39
温度越高引物二聚体越多可能是因为温度高就有多的引物没有结合到模版上去反应，最后形成了二聚体。不知道你的引物长度多少，是不是5’端加了酶切位点什么的，说的引物的信息太少，没法判断，要不试试降落pcr吧

谢谢，重新换了引物，现在已经P出来了。
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26楼2014-11-05 21:45:26
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惊叹号

金虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
19楼: Originally posted by 古木宁天 at 2014-11-03 21:18:30
有的，我有时会用这个体系扩片段。...

引物的问题，现在已经P出来了。
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27楼2014-11-05 21:46:42
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惊叹号

金虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
20楼: Originally posted by hajierlove at 2014-11-03 22:00:05
我的一个基因扩全长，引物不好，一直扩不出来，有发夹结构，温度梯度，模板量，touch down都试了，没有目的条带，只有引物二聚体，明天按你的跑一下，试试...

再换引物试试。
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28楼2014-11-05 21:47:46
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惊叹号

金虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
25楼: Originally posted by 小花猫阿 at 2014-11-04 12:26:36
温度越高，非特异性越多，所以一定要在低的退火温度循环时进行特异性富集，再升高退火温度进行循环...

谢谢
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29楼2014-11-05 21:48:45
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hajierlove

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
22楼: Originally posted by hihe99 at 2014-11-04 11:49:30
我感觉两步法还是要引物TM值高些才能有效，
你的模版检测过没，有没有问题？...

模板没有问题，同时试了两个基因，另一个做出来了，引物tm不高啊50左右，怎么办？还有什么意见吗？
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踏实
30楼2014-11-05 22:20:37
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