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hajierlove

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
28楼: Originally posted by 惊叹号 at 2014-11-05 21:47:46
再换引物试试。...

扩全长,引物不好换,从头开始设的
踏实
31楼2014-11-05 22:22:27
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hihe99

银虫 (小有名气)

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-11-06 20:35:52
引用回帖:
30楼: Originally posted by hajierlove at 2014-11-05 23:20:37
模板没有问题,同时试了两个基因,另一个做出来了,引物tm不高啊50左右,怎么办?还有什么意见吗?...

整个看了下你的回复,你是不是想扩个基因的全长cds然后酶切连到载体里面去是吧,引物的5‘端加了酶切位点。
不知道你的引物跟模版配对的那段有多长,但是tm50太低了,可以试试将引物加长,配对的那段最多加到25bp,只要3’端没有错配就可以,把tm提高。pcr的时候退火温度要根据这段的tm设计,但是建议用降落pcr;或者降落提高模版量,然后用两步法
整个引物的gc含量要合适,配对的那段gc含量那没办法,如果过低那变性到退火、退火到延伸的降温升温要慢些,把pcr设置下
希望对你有帮助,祝早日做出来!
32楼2014-11-06 11:51:28
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hajierlove

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
32楼: Originally posted by hihe99 at 2014-11-06 11:51:28
整个看了下你的回复,你是不是想扩个基因的全长cds然后酶切连到载体里面去是吧,引物的5‘端加了酶切位点。
不知道你的引物跟模版配对的那段有多长,但是tm50太低了,可以试试将引物加长,配对的那段最多加到25bp ...

谢谢你的意见,很受用,我试试。
踏实
33楼2014-11-06 11:55:01
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惊叹号

金虫 (正式写手)

引用回帖:
30楼: Originally posted by hajierlove at 2014-11-05 22:20:37
模板没有问题,同时试了两个基因,另一个做出来了,引物tm不高啊50左右,怎么办?还有什么意见吗?...

如果引物没有问题,你可以把变性和退火的温度适当延长一点。
34楼2014-11-10 18:33:23
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圣者为王

铁虫 (初入文坛)

你可以跑个管家基因的普通pcr看一下效果,看看是不是模版问题。
35楼2014-11-21 10:22:14
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