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hajierlove

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
28楼: Originally posted by 惊叹号 at 2014-11-05 21:47:46
再换引物试试。...

扩全长，引物不好换，从头开始设的
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踏实
31楼2014-11-05 22:22:27
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hihe99

银虫 (小有名气)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-11-06 20:35:52
引用回帖:
30楼: Originally posted by hajierlove at 2014-11-05 23:20:37
模板没有问题，同时试了两个基因，另一个做出来了，引物tm不高啊50左右，怎么办？还有什么意见吗？...

整个看了下你的回复，你是不是想扩个基因的全长cds然后酶切连到载体里面去是吧，引物的5‘端加了酶切位点。
不知道你的引物跟模版配对的那段有多长，但是tm50太低了，可以试试将引物加长，配对的那段最多加到25bp，只要3’端没有错配就可以，把tm提高。pcr的时候退火温度要根据这段的tm设计，但是建议用降落pcr；或者降落提高模版量，然后用两步法
整个引物的gc含量要合适，配对的那段gc含量那没办法，如果过低那变性到退火、退火到延伸的降温升温要慢些，把pcr设置下
希望对你有帮助，祝早日做出来！
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32楼2014-11-06 11:51:28
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hajierlove

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
32楼: Originally posted by hihe99 at 2014-11-06 11:51:28
整个看了下你的回复，你是不是想扩个基因的全长cds然后酶切连到载体里面去是吧，引物的5‘端加了酶切位点。
不知道你的引物跟模版配对的那段有多长，但是tm50太低了，可以试试将引物加长，配对的那段最多加到25bp ...

谢谢你的意见，很受用，我试试。
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踏实
33楼2014-11-06 11:55:01
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惊叹号

金虫 (正式写手)
引用回帖:
30楼: Originally posted by hajierlove at 2014-11-05 22:20:37
模板没有问题，同时试了两个基因，另一个做出来了，引物tm不高啊50左右，怎么办？还有什么意见吗？...

如果引物没有问题，你可以把变性和退火的温度适当延长一点。
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34楼2014-11-10 18:33:23
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圣者为王

铁虫 (初入文坛)
你可以跑个管家基因的普通pcr看一下效果，看看是不是模版问题。
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35楼2014-11-21 10:22:14
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