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惊叹号

金虫 (正式写手)

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专业: 临床生物化学检验

[求助] 怎么优化PCR体系已有2人参与

目的片段：1200bp
反应体系：cDNA:1ug 引物浓度：250nmol/l 氯化镁：1.5mmol/l Taq酶：0.5U dNTP:200umol/l
循环体系：95℃，5min; 95℃,30s; 44℃~52℃:30s; 72℃:1min30s
引物给出的Tm值最小为49℃，我58℃、60℃都跑过，但是结果都是只有引物二聚体。
引物为师兄帮忙设计，老板说没问题，上下游引物中都含有TTAATTAA酶切位点。
请教各位高手，体系还需要怎么优化？

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1楼 2014-10-31 12:36:14

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

hihe99

银虫 (小有名气)

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专业: 生物化学

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-11-06 20:35:52

引用回帖:

30楼: Originally posted by hajierlove at 2014-11-05 23:20:37
模板没有问题，同时试了两个基因，另一个做出来了，引物tm不高啊50左右，怎么办？还有什么意见吗？...

整个看了下你的回复，你是不是想扩个基因的全长cds然后酶切连到载体里面去是吧，引物的5‘端加了酶切位点。
不知道你的引物跟模版配对的那段有多长，但是tm50太低了，可以试试将引物加长，配对的那段最多加到25bp，只要3’端没有错配就可以，把tm提高。pcr的时候退火温度要根据这段的tm设计，但是建议用降落pcr；或者降落提高模版量，然后用两步法
整个引物的gc含量要合适，配对的那段gc含量那没办法，如果过低那变性到退火、退火到延伸的降温升温要慢些，把pcr设置下
希望对你有帮助，祝早日做出来！