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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 怎么优化PCR体系
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惊叹号

金虫 (正式写手)

[求助] 怎么优化PCR体系 已有2人参与

目的片段：1200bp
反应体系：cDNA:1ug    引物浓度：250nmol/l      氯化镁：1.5mmol/l       Taq酶：0.5U      dNTP:200umol/l
循环体系：95℃，5min;        95℃,30s;          44℃~52℃:30s;        72℃:1min30s
引物给出的Tm值最小为49℃，我58℃、60℃都跑过，但是结果都是只有引物二聚体。
引物为师兄帮忙设计，老板说没问题，上下游引物中都含有TTAATTAA酶切位点。
请教各位高手，体系还需要怎么优化？
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1楼 2014-10-31 12:36:14
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小花猫阿

新虫 (小有名气)
你可以在前几个退火循环里调整一个比较合适的较低的退火温度先进行特异性扩增，减少非特异性扩增，然后再升高退火温度进行接下来的退火循环，看看如何。
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23楼2014-11-04 12:21:38
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小花猫阿

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 惊叹号 at 2014-10-31 22:02:45
我用梯度PCR44℃、46℃、48℃、50℃、52℃，包括58℃、60℃我都试过了，而且有一个问题就是，温度越高，感觉引物二聚体越明显。...

对呀，所以你可以按我说的，找个较低的退火温度循环几次，增加特异性数目，然后再提高退火温度就可以了呀
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24楼2014-11-04 12:23:01
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小花猫阿

新虫 (小有名气)
引用回帖:
24楼: Originally posted by 小花猫阿 at 2014-11-04 12:23:01
对呀，所以你可以按我说的，找个较低的退火温度循环几次，增加特异性数目，然后再提高退火温度就可以了呀...

温度越高，非特异性越多，所以一定要在低的退火温度循环时进行特异性富集，再升高退火温度进行循环
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惊叹号
25楼2014-11-04 12:26:36
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