应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 大家帮我看看这个PCR如何进行优化
101/1返回列表
查看: 1382  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

Insecta_A

铜虫 (小有名气)

[求助] 大家帮我看看这个PCR如何进行优化 已有4人参与

求大神帮我看看，我的PCR产物量每次都很少，但引物二聚体较多，已做过Primer的优化，但是还是去除不了，而且每次照相都感觉很模糊，下面图片有一张是用手机照的
反应体系20ul:  Mg2+: 2mM,
                       dNTPs: 0.5mM,
                       Taq酶: 2U,
                       10X PCR Buffer: 1X,
                       Primer each 0.45uM,(我做的是双重PCR，共两队引物)
                       Template DNA: 180ng.
反应条件及程序: 采用Touchdown PCR 程序：94℃ 预变性2min； 以下只进行一次循环：94℃ 变性15s, 61/59/57/55℃退火30s, 72℃延伸45s；再进行36次循环：94℃ 变性15s, 53℃退火30s, 72℃延伸45s；72℃最后延伸2min；4℃保存。

大家帮我看看这个PCR如何进行优化
Administrator 2014-08-29 1hr 2min.jpg


大家帮我看看这个PCR如何进行优化-1
Administrator 2014-08-29 11hr 45min.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-08-31 09:18:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hajierlove

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-08-31 19:48:27
Insecta_A: 金币+2, ★有帮助 2014-08-31 20:57:11
引物二聚体不影响胶回收啊，你的目的条带是那条啊？一般touch down，跨的温度范围比较大
赞一下 回复此楼
踏实
2楼2014-08-31 18:53:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hongqifei

木虫 (小有名气)
多重PCR是比较难做吧。非得要两对引物一起扩吗？？
赞一下(1人) 回复此楼
何须剑道争锋？千人指，万人封，可问江湖鼎峰，三尺秋水尘不染，天下无双。
3楼2014-08-31 20:55:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Insecta_A

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hajierlove at 2014-08-31 18:53:09
引物二聚体不影响胶回收啊，你的目的条带是那条啊？一般touch down，跨的温度范围比较大

我的目的条带是前面两条，最下面的是引物二聚体
赞一下 回复此楼
4楼2014-08-31 20:56:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Insecta_A

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hongqifei at 2014-08-31 20:55:04
多重PCR是比较难做吧。非得要两对引物一起扩吗？？

主要是这样要方便点，再加上实验经费有点紧，所以就采用双重扩，再做毛细管检测
赞一下 回复此楼
5楼2014-08-31 20:58:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

miclebibi

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Insecta_A(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:34:59
建议你分开做两组引物，另外可以提高一下模板的浓度
切胶的时候可以跑久一点再切，没什么问题的反正你也P出来了
赞一下 回复此楼
6楼2014-09-01 09:06:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hongqifei

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Insecta_A at 2014-08-31 20:58:38
主要是这样要方便点，再加上实验经费有点紧，所以就采用双重扩，再做毛细管检测...

其实没有必要这样。分开扩了把产物混在一起检测是一样的，只多浪费一个PCR反应，扩增效果肯定好很多的。
赞一下 回复此楼
何须剑道争锋？千人指，万人封，可问江湖鼎峰，三尺秋水尘不染，天下无双。
7楼2014-09-02 21:39:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

huay13

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
Insecta_A(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-04 19:35:29
试试用高保真酶p，我开始也是用taq做出了100bp条带，换成kod的高保真酶就没有了
赞一下(1人) 回复此楼
食品是个坑
8楼2014-09-02 21:46:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Insecta_A

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by hongqifei at 2014-09-02 21:39:05
其实没有必要这样。分开扩了把产物混在一起检测是一样的，只多浪费一个PCR反应，扩增效果肯定好很多的。...

这样把产物混在一起会不会降低产物浓度啊？对后续实验有什么影响呢？
赞一下 回复此楼
9楼2014-09-03 08:51:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

393658000

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

不用Taq好多年真心的 还有你如果不是基因组PCR 不需要放那边多模板
赞一下 回复此楼
10楼2014-09-04 11:27:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 Insecta_A 的主题更新
101/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 286求调剂 +3 lemonzzn 2026-03-16 5/250 2026-03-16 20:43 by lemonzzn
[考研] 考研化学学硕调剂，一志愿985 +3 张vvvv 2026-03-15 5/250 2026-03-16 20:25 by 张vvvv
[考研] 318求调剂 +3 Yanyali 2026-03-15 3/150 2026-03-16 16:41 by houyaoxu
[考研] 070303一志愿西北大学学硕310找调剂 +5 d如愿上岸 2026-03-12 8/400 2026-03-16 15:19 by peike
[考研] 285求调剂 +6 ytter 2026-03-12 6/300 2026-03-16 15:05 by njzyff
[考研] 311求调剂 +6 冬十三 2026-03-15 6/300 2026-03-16 08:00 by wang_dand
[基金申请] NSFC申报书里申请人简历中代表性论著还需要在申报书最后的附件里面再上传一遍吗 20+5 NSFC2026我来了 2026-03-10 14/700 2026-03-15 23:53 by 不负韶华的虎
[考研] 070305求调剂 +3 mlpqaz03 2026-03-14 4/200 2026-03-15 11:04 by peike
[考研] 本科南京大学一志愿川大药学327 +3 麦田耕者 2026-03-14 3/150 2026-03-14 20:04 by 外星文明
[考研] 267一志愿南京工业大学0817化工求调剂 +5 SUICHILD 2026-03-12 5/250 2026-03-14 14:53 by jean5056
[考研] 290求调剂 +4 @将就将就看 2026-03-10 8/400 2026-03-14 14:23 by 千千运气
[考研] 材料工程专硕，一志愿中国矿业大学，总分314，求调剂 +5 无懈可击的巨人 2026-03-10 5/250 2026-03-14 00:37 by JourneyLucky
[考研] 318求调剂 +3 李新光 2026-03-10 3/150 2026-03-14 00:21 by JourneyLucky
[考研] 285 求调剂 资源与环境 一志愿北京化工大学 +3 未名考生 2026-03-10 3/150 2026-03-13 23:04 by JourneyLucky
[考研] 材料专硕350 求调剂 +4 王金科 2026-03-12 4/200 2026-03-13 16:02 by ruiyingmiao
[考研] 材料301分求调剂 +5 Liyouyumairs 2026-03-12 5/250 2026-03-13 14:42 by JourneyLucky
[考研] 268求调剂 +4 好运连绵不绝 2026-03-12 4/200 2026-03-13 10:45 by hyswxzs
[考研] 296求调剂 +3 大口吃饭 身体健 2026-03-13 3/150 2026-03-13 10:31 by 学员8dgXkO
[考研] 321求调剂（食品/专硕） +3 xc321 2026-03-12 6/300 2026-03-13 08:45 by xc321
[考研] 341求调剂 +4 捣蛋猪猪 2026-03-11 4/200 2026-03-12 14:47 by ruiyingmiao
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭