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小星丹925

木虫 (著名写手)

[交流] PCR优化如何除去出二聚体

最近PCR出来这个结果，希望懂PCR的帮帮忙，给提提建议，我应该怎么优化一下
我的目的条带第一个图是100bp，条带出了但很浅，且有二聚体，还模带，是哪里有问题呢？
第二个图是132bp的目的基因，也是条带出了 但很浅，而且有二聚体
PCR体系是 95度5min 94度30s，梯度退火30s，72度20s 终延伸10min 循环30次
温度梯度分别是图一 52-57.6（primer推荐最佳温度是50），图二 53.2-60.1（primer推荐最佳温度是53度）
希望大家帮帮忙，给点建议 非常感谢
PCR优化如何除去出二聚体
IL-4 100bp.jpg


PCR优化如何除去出二聚体-1
IFN-r 132bp.jpg
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1楼2013-12-22 14:05:38
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achonghello

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小星丹925: 金币+2, 谢谢你的帮助 那我应该将退火温度提高到多少度呢？循环次数减少到多少比较好呢？ 2013-12-22 15:54:31
提高退火温度或者减少循环次数。。。
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2楼2013-12-22 15:18:39
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不叶珏

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小星丹925: 金币+2, 谢谢 2013-12-23 09:13:18
少加引物

要根本上解决 重新设计引物
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4楼2013-12-22 17:24:00
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woshishui916

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小星丹925: 金币+2 2013-12-23 09:17:57
1、做个Touch-Down PCR吧
应该能够解决；
2、可以考虑二次扩增；
有问题再联系
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5楼2013-12-22 18:49:51
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小星丹925

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 不叶珏 at 2013-12-22 17:24:00
少加引物

要根本上解决 重新设计引物

我的引物是引用外国发的SCI文章的，
第一次P出来了，效果还行，后来就再也P不出了
引物我加的是浓度10umol的 1微升 应该减少到多少呢？
非常感谢
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6楼2013-12-23 09:15:20
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小星丹925

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by woshishui916 at 2013-12-22 18:49:51
1、做个Touch-Down PCR吧
应该能够解决；
2、可以考虑二次扩增；
有问题再联系

我现在做的就是touch-down PCR
二次扩增怎么做呢？那最后用荧光PCR进行定量，我的退火温度怎么确定最佳的呢？嘿嘿 希望得到你的进一步指点 谢谢
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7楼2013-12-23 09:17:53
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woshishui916

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by 小星丹925 at 2013-12-23 09:17:53
我现在做的就是touch-down PCR
二次扩增怎么做呢？那最后用荧光PCR进行定量，我的退火温度怎么确定最佳的呢？嘿嘿 希望得到你的进一步指点 谢谢...

你TDPCR可以再优化下
二次就是第一次产物为模板再扩增
1微升就成

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9楼2013-12-23 09:29:59
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不叶珏

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
6楼: Originally posted by 小星丹925 at 2013-12-23 09:15:20
我的引物是引用外国发的SCI文章的，
第一次P出来了，效果还行，后来就再也P不出了
引物我加的是浓度10umol的 1微升 应该减少到多少呢？
非常感谢...

2~5um 终浓度 试试
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11楼2013-12-23 09:58:01
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不叶珏

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 小星丹925 at 2013-12-23 09:15:20
我的引物是引用外国发的SCI文章的，
第一次P出来了，效果还行，后来就再也P不出了
引物我加的是浓度10umol的 1微升 应该减少到多少呢？
非常感谢...

2~5um 终浓度 试试
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12楼2013-12-23 09:58:19
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不叶珏

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 小星丹925 at 2013-12-23 09:15:20
我的引物是引用外国发的SCI文章的，
第一次P出来了，效果还行，后来就再也P不出了
引物我加的是浓度10umol的 1微升 应该减少到多少呢？
非常感谢...

2~5um 终浓度 试试
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13楼2013-12-23 09:58:34
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不叶珏

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 小星丹925 at 2013-12-23 09:15:20
我的引物是引用外国发的SCI文章的，
第一次P出来了，效果还行，后来就再也P不出了
引物我加的是浓度10umol的 1微升 应该减少到多少呢？
非常感谢...

2~5um 终浓度 试试
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14楼2013-12-23 09:58:43
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小星丹925

木虫 (著名写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 不叶珏 at 2013-12-23 09:58:43
2~5um 终浓度 试试...

我试了 加引物5um，结果二聚体是少了，但好像还有点模带，给你看一下我的PCR图，我应该再怎么改进呢？ 谢谢  图片的右边是我做的梯度 目的基因片段 132bp
PCR优化如何除去出二聚体-2
IL-4 IFN-R  (引物加0.5微升)梯度：IL-4：50-57；IL-10 54.7-58.1 60 .jpg

[ Last edited by 小星丹925 on 2013-12-26 at 11:25 ]
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15楼2013-12-26 11:22:14
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westlife9113楼
2013-12-22 16:50   回复  
小星丹9258楼
2013-12-23 09:20   回复  
引用回帖:
3楼: Originally posted by westlife911 at 2013-12-22 16:50:48

sjmr122110楼
2013-12-23 09:36   回复  
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