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小星丹925

木虫 (著名写手)

[交流] PCR优化如何除去出二聚体

最近PCR出来这个结果，希望懂PCR的帮帮忙，给提提建议，我应该怎么优化一下
我的目的条带第一个图是100bp，条带出了但很浅，且有二聚体，还模带，是哪里有问题呢？
第二个图是132bp的目的基因，也是条带出了 但很浅，而且有二聚体
PCR体系是 95度5min 94度30s，梯度退火30s，72度20s 终延伸10min 循环30次
温度梯度分别是图一 52-57.6（primer推荐最佳温度是50），图二 53.2-60.1（primer推荐最佳温度是53度）
希望大家帮帮忙，给点建议 非常感谢
PCR优化如何除去出二聚体
IL-4 100bp.jpg


PCR优化如何除去出二聚体-1
IFN-r 132bp.jpg
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1楼2013-12-22 14:05:38
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小星丹925

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by woshishui916 at 2013-12-22 18:49:51
1、做个Touch-Down PCR吧
应该能够解决；
2、可以考虑二次扩增；
有问题再联系

我现在做的就是touch-down PCR
二次扩增怎么做呢？那最后用荧光PCR进行定量，我的退火温度怎么确定最佳的呢？嘿嘿 希望得到你的进一步指点 谢谢
赞一下 回复此楼
7楼2013-12-23 09:17:53
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achonghello

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小星丹925: 金币+2, 谢谢你的帮助 那我应该将退火温度提高到多少度呢？循环次数减少到多少比较好呢？ 2013-12-22 15:54:31
提高退火温度或者减少循环次数。。。
赞一下 回复此楼
2楼2013-12-22 15:18:39
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不叶珏

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小星丹925: 金币+2, 谢谢 2013-12-23 09:13:18
少加引物

要根本上解决 重新设计引物
赞一下 回复此楼
4楼2013-12-22 17:24:00
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woshishui916

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小星丹925: 金币+2 2013-12-23 09:17:57
1、做个Touch-Down PCR吧
应该能够解决；
2、可以考虑二次扩增；
有问题再联系
赞一下 回复此楼
5楼2013-12-22 18:49:51
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小星丹9258楼
2013-12-23 09:20   回复  
引用回帖:
3楼: Originally posted by westlife911 at 2013-12-22 16:50:48

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