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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR条带极弱，二聚体很亮，应如何调整？
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)

[求助] PCR条带极弱，二聚体很亮，应如何调整？ 已有1人参与

PCR条带极弱，二聚体很亮，应如何调整？53度只有二聚体无目的带，54，55度二聚体亮，目的带极弱，在紫外灯下看不清楚！应如何调整退火温度呢？
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1楼 2012-11-28 19:13:20
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
使用PCR产物（目的带位置正确但暗淡，二聚体较亮）作为二次 PCR的模板，25微升的体系应该加多少呢？
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2楼2012-11-28 19:35:51
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
2楼: Originally posted by yuguiyan at 2012-11-28 19:35:51
使用PCR产物（目的带位置正确但暗淡，二聚体较亮）作为二次 PCR的模板，25微升的体系应该加多少呢？

果断提高退火温度，或者做个降落PCR，把初始温度提高。。。使用PCR产物为模板，可能P不出来哦，因为突变的可能性太大，如果要P就把PCR产物稀释100倍，然后按照正常PCR条件加就行了。。。我试过，这样做特异性不强。。。
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keepon
3楼2012-11-28 19:57:42
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adajf

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果目的条带若 稀释50倍试试好了  可以设个梯度pcr看看
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4楼2012-11-28 22:19:31
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Arrennew

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
换好酶（takara probest　能力很强），提高退火温度（60以上）。
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生命不息，探索不止。
5楼2012-11-28 22:41:00
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bloodwar

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你引物不好吧，按说提高温度二聚体应该更少才对啊。再降低镁离子、dNTP和引物的浓度吧
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6楼2012-11-29 05:15:30
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1，降低镁离子浓度
2，提高退火温度到65，,68， 70 三个温度试试
3，加入适量DMSO
4，用高保真酶
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7楼2012-11-29 08:44:14
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aoyiluo

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

首先做个梯度PCR摸索条件，看看情况，再视情况考虑改变其他条件
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tomorrow is another day
8楼2012-12-05 20:06:37
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唐朝豪放男

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-05-29 16:01:29
二聚体多的原因有很多，给你几个建议，由简至难：
0：检测你的引物，这个是基本
1：增加预变性时间
2：冷启动
3：热启动
4：降落PCR
5：换酶
6：换PCR的Buffer
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9楼2013-05-29 12:31:16
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

有可能是模板浓度太低了，适当增加模板的用量试试
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rainwater
10楼2014-01-07 15:38:44
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