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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)

[求助] PCR条带极弱,二聚体很亮,应如何调整? 已有1人参与

PCR条带极弱,二聚体很亮,应如何调整?53度只有二聚体无目的带,54,55度二聚体亮,目的带极弱,在紫外灯下看不清楚!应如何调整退火温度呢?
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)

使用PCR产物(目的带位置正确但暗淡,二聚体较亮)作为二次 PCR的模板,25微升的体系应该加多少呢?
2楼2012-11-28 19:35:51
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
引用回帖:
2楼: Originally posted by yuguiyan at 2012-11-28 19:35:51
使用PCR产物(目的带位置正确但暗淡,二聚体较亮)作为二次 PCR的模板,25微升的体系应该加多少呢?

果断提高退火温度,或者做个降落PCR,把初始温度提高。。。使用PCR产物为模板,可能P不出来哦,因为突变的可能性太大,如果要P就把PCR产物稀释100倍,然后按照正常PCR条件加就行了。。。我试过,这样做特异性不强。。。
keepon
3楼2012-11-28 19:57:42
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adajf

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
如果目的条带若 稀释50倍试试好了  可以设个梯度pcr看看
4楼2012-11-28 22:19:31
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Arrennew

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
换好酶(takara probest 能力很强),提高退火温度(60以上)。
生命不息,探索不止。
5楼2012-11-28 22:41:00
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bloodwar

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你引物不好吧,按说提高温度二聚体应该更少才对啊。再降低镁离子、dNTP和引物的浓度吧
6楼2012-11-29 05:15:30
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
1,降低镁离子浓度
2,提高退火温度到65,,68, 70 三个温度试试
3,加入适量DMSO
4,用高保真酶
7楼2012-11-29 08:44:14
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aoyiluo

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

首先做个梯度PCR摸索条件,看看情况,再视情况考虑改变其他条件
tomorrow is another day
8楼2012-12-05 20:06:37
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唐朝豪放男

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-05-29 16:01:29
二聚体多的原因有很多,给你几个建议,由简至难:
0:检测你的引物,这个是基本
1:增加预变性时间
2:冷启动
3:热启动
4:降落PCR
5:换酶
6:换PCR的Buffer
9楼2013-05-29 12:31:16
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

有可能是模板浓度太低了,适当增加模板的用量试试
rainwater
10楼2014-01-07 15:38:44
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