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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 大家帮我看看这个PCR如何进行优化
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Insecta_A

铜虫 (小有名气)

[求助] 大家帮我看看这个PCR如何进行优化 已有4人参与

求大神帮我看看，我的PCR产物量每次都很少，但引物二聚体较多，已做过Primer的优化，但是还是去除不了，而且每次照相都感觉很模糊，下面图片有一张是用手机照的
反应体系20ul:  Mg2+: 2mM,
                       dNTPs: 0.5mM,
                       Taq酶: 2U,
                       10X PCR Buffer: 1X,
                       Primer each 0.45uM,(我做的是双重PCR，共两队引物)
                       Template DNA: 180ng.
反应条件及程序: 采用Touchdown PCR 程序：94℃ 预变性2min； 以下只进行一次循环：94℃ 变性15s, 61/59/57/55℃退火30s, 72℃延伸45s；再进行36次循环：94℃ 变性15s, 53℃退火30s, 72℃延伸45s；72℃最后延伸2min；4℃保存。

大家帮我看看这个PCR如何进行优化
Administrator 2014-08-29 1hr 2min.jpg


大家帮我看看这个PCR如何进行优化-1
Administrator 2014-08-29 11hr 45min.jpg
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1楼 2014-08-31 09:18:53
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hajierlove

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-08-31 19:48:27
Insecta_A: 金币+2, ★有帮助 2014-08-31 20:57:11
引物二聚体不影响胶回收啊，你的目的条带是那条啊？一般touch down，跨的温度范围比较大
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踏实
2楼2014-08-31 18:53:09
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hongqifei

木虫 (小有名气)
多重PCR是比较难做吧。非得要两对引物一起扩吗？？
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何须剑道争锋？千人指，万人封，可问江湖鼎峰，三尺秋水尘不染，天下无双。
3楼2014-08-31 20:55:04
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Insecta_A

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hajierlove at 2014-08-31 18:53:09
引物二聚体不影响胶回收啊，你的目的条带是那条啊？一般touch down，跨的温度范围比较大

我的目的条带是前面两条，最下面的是引物二聚体
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4楼2014-08-31 20:56:42
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Insecta_A

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hongqifei at 2014-08-31 20:55:04
多重PCR是比较难做吧。非得要两对引物一起扩吗？？

主要是这样要方便点，再加上实验经费有点紧，所以就采用双重扩，再做毛细管检测
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5楼2014-08-31 20:58:38
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miclebibi

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Insecta_A(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-01 19:34:59
建议你分开做两组引物，另外可以提高一下模板的浓度
切胶的时候可以跑久一点再切，没什么问题的反正你也P出来了
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6楼2014-09-01 09:06:34
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hongqifei

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Insecta_A at 2014-08-31 20:58:38
主要是这样要方便点，再加上实验经费有点紧，所以就采用双重扩，再做毛细管检测...

其实没有必要这样。分开扩了把产物混在一起检测是一样的，只多浪费一个PCR反应，扩增效果肯定好很多的。
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何须剑道争锋？千人指，万人封，可问江湖鼎峰，三尺秋水尘不染，天下无双。
7楼2014-09-02 21:39:05
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huay13

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
Insecta_A(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-04 19:35:29
试试用高保真酶p，我开始也是用taq做出了100bp条带，换成kod的高保真酶就没有了
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食品是个坑
8楼2014-09-02 21:46:40
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Insecta_A

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by hongqifei at 2014-09-02 21:39:05
其实没有必要这样。分开扩了把产物混在一起检测是一样的，只多浪费一个PCR反应，扩增效果肯定好很多的。...

这样把产物混在一起会不会降低产物浓度啊？对后续实验有什么影响呢？
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9楼2014-09-03 08:51:04
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393658000

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

不用Taq好多年真心的 还有你如果不是基因组PCR 不需要放那边多模板
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10楼2014-09-04 11:27:07
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