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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 怎么优化PCR体系
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惊叹号

金虫 (正式写手)

[求助] 怎么优化PCR体系 已有2人参与

目的片段：1200bp
反应体系：cDNA:1ug    引物浓度：250nmol/l      氯化镁：1.5mmol/l       Taq酶：0.5U      dNTP:200umol/l
循环体系：95℃，5min;        95℃,30s;          44℃~52℃:30s;        72℃:1min30s
引物给出的Tm值最小为49℃，我58℃、60℃都跑过，但是结果都是只有引物二聚体。
引物为师兄帮忙设计，老板说没问题，上下游引物中都含有TTAATTAA酶切位点。
请教各位高手，体系还需要怎么优化？
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1楼 2014-10-31 12:36:14
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小花猫阿

新虫 (小有名气)
你可以在前几个退火循环里调整一个比较合适的较低的退火温度先进行特异性扩增，减少非特异性扩增，然后再升高退火温度进行接下来的退火循环，看看如何。
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23楼2014-11-04 12:21:38
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synbio

新虫 (初入文坛)
试一下47℃退火。
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4楼2014-10-31 14:15:16
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hajierlove

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
惊叹号: 金币+20, ★有帮助 2014-10-31 22:03:41
cDNA1ug吗？还是1ul，1ul太多了，20ng就可以p出来了，你的时间可以设一个梯度，从45左右到60
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踏实
5楼2014-10-31 20:08:31
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惊叹号

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by synbio at 2014-10-31 14:15:16
试一下47℃退火。

我用梯度PCR44℃、46℃、48℃、50℃、52℃，包括58℃、60℃我都试过了，而且有一个问题就是，温度越高，感觉引物二聚体越明显。
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6楼2014-10-31 22:02:45
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