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引物GC含量高，怎么调整PCR体系？ 已有7人参与
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想得到一个已知基因序列的耐盐基因（该基因GC含量为36.76%）设计了两对特异性引物， 第1对：F:ATGGGGATAAGTTTAGCAGCC R：CTAAAATGGATGCACACTTGG 这对引物之间有互补。 Tm值分别为：58.0和56.1； GC含量：47.6和42.9。 设置退火温度：47、49、51、53、55、57，没扩出来。 第2对：F: 5' ATCATCGGACATTTACTCG 3' R: 5' CGCATCCATTCCAACATAG 3' 无互补、发夹结构等等 Tm值分别是53.2和55.4，GC含量分别是42.1和47.4。 这对引物用的25ulPCR体系，退火温度设置梯度：46、48、50、52、54、55度，一直没扩增出来。 后来增加了模板量至2.5ul和2.8ul，设置退火温度：42、44、50，也没扩出来。 后来查资料，可能是GC含量太低的问题。那怎么调整PCR反应体系和PCR程序体系。哪个高手支支招呗？万分感谢！ 所用的PCR体系是25ul体系：ddH2O: 15.8ul， 10xbuffer: 2.5ul， 10mM dNTP:0.5ul， 25mM MgCl2: 2.0ul， 10um 上、下游引物各1.0ul， 模板：2.0ul， 5U Taq DNA聚合酶：0.2ul |
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zeroon
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