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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 引物GC含量高，怎么调整PCR体系？
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lu12306

新虫 (初入文坛)

[求助] 引物GC含量高，怎么调整PCR体系？已有7人参与

想得到一个已知基因序列的耐盐基因（该基因GC含量为36.76%）设计了两对特异性引物，
第1对：F:ATGGGGATAAGTTTAGCAGCC    R：CTAAAATGGATGCACACTTGG   这对引物之间有互补。
             Tm值分别为：58.0和56.1；  GC含量：47.6和42.9。
        设置退火温度：47、49、51、53、55、57，没扩出来。
第2对：F:   5'  ATCATCGGACATTTACTCG  3'   R:   5'  CGCATCCATTCCAACATAG  3'  无互补、发夹结构等等
            Tm值分别是53.2和55.4，GC含量分别是42.1和47.4。
这对引物用的25ulPCR体系，退火温度设置梯度：46、48、50、52、54、55度，一直没扩增出来。
后来增加了模板量至2.5ul和2.8ul，设置退火温度：42、44、50，也没扩出来。



后来查资料，可能是GC含量太低的问题。那怎么调整PCR反应体系和PCR程序体系。哪个高手支支招呗？万分感谢！

                               所用的PCR体系是25ul体系：ddH2O: 15.8ul，
                                                                            10xbuffer: 2.5ul，
                                                                            10mM dNTP:0.5ul，
                                                                          25mM MgCl2: 2.0ul，
                                                                        10um 上、下游引物各1.0ul，
                                                                              模板：2.0ul，
                                                                        5U Taq DNA聚合酶：0.2ul
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1楼2014-09-05 12:21:51
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zuoyly

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-05 17:16:56
用PCR Enhancer就行，这个是专门针对GC含量高的引物设计的。
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2楼2014-09-05 16:50:31
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普通回帖

zeroon

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-09-09 09:58:14
既然已知了基因，一般设计的PCR引物至少也能p出一些杂带来吧？建议楼主再仔细对照检查一下PCR引物设计的问题，比如方向对不对？等等一些基本的问题。
我是新手，发生过这样的事情，当然lz不一定出错，我站在自己的角度提醒一下。
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3楼2014-09-05 23:05:30
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lu12306

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zeroon at 2014-09-05 23:05:30
既然已知了基因，一般设计的PCR引物至少也能p出一些杂带来吧？建议楼主再仔细对照检查一下PCR引物设计的问题，比如方向对不对？等等一些基本的问题。
我是新手，发生过这样的事情，当然lz不一定出错，我站在自己的 ...

我比较担心的是设计引物时最后进行特异性检测，用的是primer-blast。开始的时候blast结果能显示扩增区域，特异性不错。
可是后来检测时总是显示Specified left primer cannot be found in template...make sure this primer is on the plus strand of your template.
用的primer5.0设计的引物，设计完正向和反向引物后直接用软件中的copy功能复制的引物序列，我觉得不会出现方向问题。
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4楼2014-09-06 09:26:53
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三撇五撇

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-08 22:11:06
1，检查PCR所用的试剂，酶等是否有效。
2，检查引物是否涉及合理。
3，基因平均GC36.76%，引物GC含量：47.6和42.9，那么我猜该基因的GC含量很不平均，忽高忽低。
试试梯度法吧，从30度开始梯度上升至48度。每个循环增加0.7度。
理论上 遇到GC走势忽高忽低，用梯度升 或者梯度降都可以搞定
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5楼2014-09-07 21:59:13
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snoopytbw

荣誉版主 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-09-09 09:58:19
这叫GC高么。。。40-60呀大哥。。。。用软件的tm必然不准的，通常要做个温度梯度pcr一般tm会比软件的略低。如果你做q，那就直接用吧，不打紧

[ 发自小木虫客户端 ]
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6楼2014-09-08 08:15:26
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lu12306

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 三撇五撇 at 2014-09-07 21:59:13
1，检查PCR所用的试剂，酶等是否有效。
2，检查引物是否涉及合理。
3，基因平均GC36.76%，引物GC含量：47.6和42.9，那么我猜该基因的GC含量很不平均，忽高忽低。
试试梯度法吧，从30度开始梯度上升至48度。每个循 ...

谢谢！我现在再做一个梯度试试。
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7楼2014-09-08 08:19:49
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三撇五撇

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by lu12306 at 2014-09-08 08:19:49
谢谢！我现在再做一个梯度试试。...

做出来了么？今天我还遇到一个类似的 梯度0.2做出来的
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8楼2014-09-13 20:51:02
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踏实的心

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

把退火温度往上调调看
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9楼2014-09-13 21:50:23
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lu12306

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 三撇五撇 at 2014-09-13 20:51:02
做出来了么？今天我还遇到一个类似的 梯度0.2做出来的...

啊  这也能行？！   0.2的梯度！我从没考虑过这么小的梯度差距。受教了！
谢谢哈! 我还得接着努力呀。fighting！
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10楼2014-09-13 21:58:20
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