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baby0032

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于GC含量高的模板

各位大侠，请求帮助~~
1.我的基因组是链霉菌，GC含量很高，有没有哪家测这方面比较靠谱的测序公司推荐一个呀？
2.之前测序了几个基因，但是都发现了同一个问题，比如送了一个基因的两个克隆子（菌液，即平行样）但是这两个的测序结果碱基竟然有7~8个不一样，是用EX TAQ做的，而且片段才将近1K，之前做克隆时都没发现这样的情况。请问这是什么问题呢？
小妹囊中羞涩，悬赏较少，还望各位大侠帮帮可怜的路人吧~~
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1楼 2011-12-13 16:58:42
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回帖置顶 ( 共有1个 )

yabxxh

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
mengfei8336(MolEPI+1): 谢谢参与。 2011-12-15 09:26:03
baby0032(金币+1): 2011-12-16 11:13:54
呵呵，我刚做完了一个基因，GC含量片段前端局部高达87%，片段长3kb。Taq酶我也是一路涌过来的。不要用EXTAQ，也不要用LA TAQ，Prime Star with GC Buffer才是王道。ExTaq我没用过，因为它根本不入我的法眼，Lataq With GC buffer我前期一直用，效果不咋地，根本得不到片段，现在还有几管新的躺在我的冰箱。当然了，我的片段比较长，可能你的1KB能搞定也说不定。不过带gc buffer 的lataq和primestar价格方面来说，prime star才贵了50，我们为什么不一步到位直接用primestar呢。
希望对你有点帮助，好运
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8楼2011-12-15 09:13:55
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普通回帖

blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+1): 鼓励 2011-12-13 19:09:40
楼主的GC含量能达到百分之八十吗？可以用Takara的LA-TAQ + GC Buffer I试一下？测序可以到英俊或是生工试一下。
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jiayoubashaonian
2楼2011-12-13 18:49:53
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baby0032

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-12-13 18:49:53:
楼主的GC含量能达到百分之八十吗？可以用Takara的LA-TAQ + GC Buffer I试一下？测序可以到英俊或是生工试一下。

大概70%左右，恩，我已经订购了LA TAQ准备试试，昨天用Fermentas的pfu做了下发现效果很不好~~不过因为换了台PCR仪。我的测序结果是英俊测的哦~~我很疑惑这样的测序结果如果基因组不纯会不会造成呢？
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3楼2011-12-14 09:10:41
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): Good！ 2011-12-16 12:08:33
引用回帖:
3楼: Originally posted by baby0032 at 2011-12-14 09:10:41:
大概70%左右，恩，我已经订购了LA TAQ准备试试，昨天用Fermentas的pfu做了下发现效果很不好~~不过因为换了台PCR仪。我的测序结果是英俊测的哦~~我很疑惑这样的测序结果如果基因组不纯会不会造成呢？

LA-TAQ 加上GC BUFFER 1应该没问题的，我们的物种GC含量也很高，平均到66%,一直用的这个组合还可以。
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jiayoubashaonian
4楼2011-12-14 12:31:46
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syn1985

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我也是做链霉菌的啊 我的模板GC含量有高达80%的 可是我在英俊他们家测序结果没有问题 我还是测得3KB的呢 他们家测序还是很不错的
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5楼2011-12-14 17:04:40
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baby0032

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-12-14 12:31:46:
LA-TAQ 加上GC BUFFER 1应该没问题的，我们的物种GC含量也很高，平均到66%,一直用的这个组合还可以。

看网上很多人说LA TAQ的突变率很高呀~~是不是这样呢？但是看说明书上是说保真性还不错的~
LA的扩增效率也是1k/min?
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6楼2011-12-14 22:17:22
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+2): Good！ 2011-12-16 12:08:57
LA 突变率在一两千没问题，多挑几个克隆。但是如果是高GC 而且复杂模板结构，串连重复，连续多个相同碱基，那它的突变频率高的让人无法接受。毕竟它不是保真酶，无法校正，因此换有校正活性的酶才是正道
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7楼2011-12-15 08:20:54
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): good 2011-12-16 12:09:45
引用回帖:
8楼: Originally posted by yabxxh at 2011-12-15 09:13:55:
呵呵，我刚做完了一个基因，GC含量片段前端局部高达87%，片段长3kb。Taq酶我也是一路涌过来的。不要用EXTAQ，也不要用LA TAQ，Prime Star with GC Buffer才是王道。ExTaq我没用过，因为它根本不入我的法眼，Lataq ...

程序稍有变化，楼主可以试一下，曾经用这个扩出过7.3k的片段，无碱基错误.
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jiayoubashaonian
9楼2011-12-15 09:54:56
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baby0032

新虫 (初入文坛)
悔啊，要是早看到就好了，刚刚买了LA，因为周围人以前有用过LA说效果不错，早知道就买primerstar了。因为我的模板就是GC在70%左右滴呀~~
我这次打算PCR后直接送出去测序，不自己做克隆了~~（不过我一直有个疑惑是如果我们自己做克隆，那么还要多跳几个去测序，有时才能测到准确的，但是如果PCR完直接送出去纯化测序呢？那不是只会有一个结果？）
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10楼2011-12-15 10:36:10
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