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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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plantst5928

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】低GC含量的模板设计引物 已有6人参与

本人最近要做一个基因的互补,用CDNA为模板区扩增该基因的CDS,但是设计的引物一直扩不出来,我不停的更换引物,加大长度,提高TM值等,但是没有收到有效的结果,扩增的特意性很差。后来我发现我的模板的GC含量比较低,不到30%。设计引物的TM值也不高,我尝试在酶切微点的额保护碱基处多加几个GC,也不行。对于GC含量低的模板,大家有什么好方法得到比较特异的扩增吗?
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虫子火箭兵

金虫 (正式写手)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
scelab(金币+1):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-05-05 15:36:47
加保护碱基一般来说是不行的,因为在扩增的时候 保护碱基是不会与模板结合的,这样你的Tm值还是不会提高,把退火温度做个梯度,适当的调高一下看看
2楼2010-05-05 08:19:03
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stliimoon

金虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
同意楼上意见,先做一下温度梯度,确定一下比较好的退火温度,要不你做个TD PCR看一下,这样可能效率比较高
3楼2010-05-05 08:34:20
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plantst5928

铜虫 (小有名气)

具体怎么做梯度?是不是把相近的温度挨个试试?什么是TD pcr?
4楼2010-05-05 14:36:58
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love_st

金虫 (著名写手)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引物长度适当的增加看看,综合考虑,我想没有那么难的
5楼2010-05-05 14:53:07
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liyong1981

金虫 (正式写手)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
加引物长度了撒。这是最具性价比的方法
6楼2010-05-05 14:54:52
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wordsworth3180

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by plantst5928 at 2010-05-05 14:36:58:
具体怎么做梯度?是不是把相近的温度挨个试试?什么是TD pcr?

touch-down pcr
7楼2010-05-05 15:49:02
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plantst5928

铜虫 (小有名气)

我已经把引物长度加长到了40bp,还是没有扩增出来啊。
8楼2010-05-05 18:39:36
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